景天三七总酚酸的提取工艺及抗氧化性研究
2020-05-08杨艳俊杨秀东王亚红
杨艳俊,杨秀东,王亚红
(吉林化工学院 化学与制药工程学院 ,吉林 吉林 132000)
景天三七(SedumaizoomL.)为景天科景天属多年生草本植物的全草,又名土三七、土人参、马三七、养心草等,分布广泛,在我国华北、东北、西北及长江流域山地、林缘、林下、河岸及阴湿草地均有生长[1-2].景天三七味甘、性平、微酸,肝经、归心,有止血、活血化瘀等功效,临床用于治疗吐血、便血、跌打损伤、清热凉血、安神补血、外伤出血[3],还用于治疗神经衰弱、失眠、烦躁不安[4]等症状.现代药理研究表明,其含有生物碱、多种酚酸、谷甾醇、黄酮类[5-6]、齐墩果酸、景天庚糖及多种挥发油[7]等药用成分,且无毒副作用,景天三七还具有良好的抗氧化作用[8].景天三七酚酸化合物主要成分为没食子酸、对羟基苯甲酸、没食子酸甲酯等[9].酚酸类化合物具有抗炎、抗病毒、抗癌、凝血、抗氧化以及调节生理活性等作用.景天三七还可以加工成保健食品、药品、茶饮料[10]等产品.景天三七抗氧化能力较强,陈惠卿的土三七总酚酸抗氧化活性的研究表明在3个不同的抗氧化活性评价模型中,土三七总酚酸呈现了不同的抗氧化活性[11].提取酚酸的方法主要有水浸提法、有机溶剂法、超声辅助法[12]、碱液提取法、微波辅助提取法[13-14]和超临界CO2萃取法[15]等.本实验考察的是超声辅助法提取景天三七总酚酸.
1 材料与方法
1.1 材料
没食子酸,HPLC≥98%,DPPH≥98%,ABTS(≥98%),维生素C(≥99%)均来自上海伊卡生物技术有限公司;无水乙醇、三氯化铁,浓盐酸,铁氰化钾,十二烷基硫酸钠,过硫酸钾均为分析纯.
1.2 仪器与设备
RT-08型粉碎机,北京开创同和发展有限公司;TD6001C型电子天平,天津天马衡基仪器有限公司;FA2204N型分析天平,上海菁海仪器有限公司;HH-1型数显恒温水浴锅,金坛市科析仪器有限公司;DHG-9246A电热恒温鼓风干燥箱,上海精宏实验设备有限公司;SHZ-D(Ⅲ)型循环水式多用真空泵,巩义市予华仪器有限责任公司;752N型紫外分光光度计,上海菁华科技仪器有限公司;KQ-250DE型超声清洗器,昆山市超声仪器有限公司.
1.3 实验方法
1.3.1 对照品及供试品溶液配制
精密称取5 mg没食子酸标准品加入到250 mL容量瓶中,加入无水乙醇至刻度线,配成浓度为20 μg/mL的标准品溶液.
精密称取2 g景天三七粉末于100 mL烧瓶中,加入70%乙醇溶液浸泡1 h,在一定条件下的超声清洗器中提取,提取液减压抽滤,定容到50 mL容量瓶中,用1 mL移液管吸取1 mL提取液置于50 mL容量瓶中,定容,为待测溶液.
1.3.2 标准曲线的绘制
通过实验方法学研究得知,精密度实验RSD=0.98%,重现性实验RSD=2.4%,稳定性实验在20~45 min时最稳定.
精密吸取6份“1.3.1”项下的已知总酚酸含量的提取液,按“1.3.2”项下方法测定吸光度,总酚酸量记为G1,每份加入总酚酸量记为G2对照品溶液,测定混合液的吸光度值,总酚酸量记为G3,加样回收率的计算式为(G3- G1)/G2,6份数据平均,并计算偏差.
1.3.3 供试品含量测定及提取率计算
精密移取1 mL已配制好的供试品溶液,置于25 mL容量瓶中,按1.3.2方法测吸光度,代入标准曲线计算样品中总酚酸的提取率.提取率计算公式:
(1)
其中W为总酚酸的提取率,%;c为紫外分光光度计测得的吸光度按照标准曲线计算得到的总酚酸的浓度,mg/mL;V为测吸光度时供试品溶液的体积,mL;m为药材景天三七的质量,g.
1.3.4 单因素实验
1.3.4.1料液比对总酚酸提取率的影响
1.3.4.2 温度对总酚酸提取率的影响
1.3.4.3 提取时间对总酚酸提取率的影响
1.3.4.4 乙醇浓度对总酚酸率的影响
1.3.5 正交实验
根据相关文献及单因素实验结果来设计正交实验.考虑乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间4个因素对景天三七总酚酸提取的影响,每个因素设计3个水平,按照L9(34)正交设计表来进行正交实验,验证提取的最佳条件,如表1所示.
表1 总酚酸提取率的正交实验水平设计
1.3.6 抗氧化实验
1.3.6.1 对DPPH自由基的清除能力
量取不同浓度景天三七提取液加入DPPH溶液[16],在517 nm处测定吸光度为A样品.将不同浓度的供试品溶液加入测定吸光度记为A对照.用蒸馏水代替供试品溶液,加入DPPH溶液,在517 nm处测定吸光度记为A空白.用同样条件测定Vc对DPPH自由基的清除能力.DPPH清除率清除率%=(A空白-A样品+A对照)/A空白×100%.
1.3.6.2 对ABTS自由基阳离子的清除
将配制的ABTS自由基阳离子溶液[17]在波长734 nm处测量吸光度并记为A空白.不同浓度的供试品溶液测其吸光度值A.用Vc作为对照,将Vc配成不同浓度按照上述方法进行实验,测得Vc对ABTS自由基阳离子的清除率.ABTS阳离子自由基清除率的清除率%=(A空白-A)/A空白×100%.
2 结果与分析
2.1 加样回收率实验结果
加样回收率的实验结果如表2所示,平均加样回收率为99.22%,RSD为1.71%,表明数据准确度较好.
表2 回收率结果
2.2 单因素实验
2.2.1 料液比对总酚酸提取率的影响
不同料液比的总酚酸提取率分别为2.50%、3.30%、3.28%、3.27%、3.29%.
料液比图1 料液比对总酚酸提取率的影响
2.2.2 温度对总酚酸提取率的影响
不同提取温度的总酚酸含量分别为2.55%、2.76%、3.19%、3.10%、2.96%.由图2可知随着温度的升高,总酚酸的提取率逐渐增大.当温度达到50 ℃时,总酚酸的提取率达到最大,最适宜提取温度为50 ℃.
温度/℃图2 温度对总酚酸提取率的影响
2.2.3 提取时间对总酚酸提取率的影响
提取时间的总酚酸提取率分别为2.55%、2.89%、3.00%、3.19%、3.10%.
由图3可知随着提取时间的增长,总酚酸的提取率逐渐增大.当提取时间达到60 min时,提取率最高,选择提取时间为60 min最为合适.
时间/min图3 提取时间对总酚酸提取率的影响
2.2.4 乙醇浓度对总酚酸提取率的影响
不同乙醇浓度的总酚酸提取率分别为2.68%、2.96%、3.27%、3.35%、2.68%.
由图4可知,随着乙醇浓度的增大,总酚酸的提取率也不断提高.当乙醇浓度为70%时,提取率达到最高,应该在此浓度下溶媒的极性与所提取的总酚酸相当,所以提取效果最好,再继续提高乙醇浓度时,溶媒极性下降后导致总酚酸的提取率也不断随之下降,乙醇浓度选择为70%时最为合适.
乙醇浓度/%图4 乙醇浓度对总酚酸提取率的影响
2.3 正交实验
正交实验结果如表3所示.由表可知,RT>Rt>RE>Rc,即在景天三七总酚酸的提取工艺中,影响因素最大的是提取温度,其次为提取时间、提取料液比,乙醇浓度最小.以最小误差项作为来源项,其中提取时间、提取温度、提取料液比的影响差异显著,乙醇浓度对提取影响较小.由于c因素水平离差平方和较小,证明c因素是由于实验误差导致因素水平数值的变化,故将c因素作为误差项.
表3 总酚酸提取的正交实验结果与分析
表4 方差来源结果分析
2.4 验证实验
2.5 抗氧化实验
2.5.1 对DPPH自由基的清除能力
景天三七提取液对DPPH自由基清除率分别为:62.73%、68.77%、78.60%、84.56%、90.60%、96.89%,Vc对DPPH自由基清除率分别为:66.48%、80.24%、91.07%、94.62%、96.99%、98.82%.
由图5可知,景天三七总酚酸提取液对DPPH自由基清除能力随着浓度的增大而增大,与Vc相比略低,浓度为0.6 mg·mL-1时清除率能达到96.89%.
溶液浓度/(mg·mL-1)图5 景天三七提取液与Vc溶液对DPPH自由基清除能力对比
2.5.2 对ABTS自由基的清除能力及结果分析
景天三七提取液对ABTS自由基清除率分别为:37.55%、61.17%、64.30%、72.20%、83.07%、97.01%,Vc对ABTS自由基清除率分别为:56.70%、62.39%、65.53%、78.06%、85.74%、97.29%.
由图6可知,景天三七提取液对ABTS自由基清除率随着提取液浓度的增加而增大,在浓度为0.6 mg/mL时,对ABTS的清除率达到97.01%,与Vc相接近.
溶液浓度/(mg·mL-1)图6 景天三七提取液与Vc溶液对ABTS自由基清除能力对比
3 结 论
景天三七提取溶液对DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除能力与Vc的对比可以得出,景天三七提取液与Vc溶液具有相近的体外抗氧化活性.