不同品种茶叶指纹图谱的建立及其相似度评价

张玲玲,孔 娟,李小芬,冯 华,王祥培,吴红梅,*

(1.贵州中医药大学,贵州贵阳 550025;2.遵义食品药品检验所,贵州遵义 563002)

茶是世界三大非酒精饮料之一,其地位仅次于水[1]。茶是山茶科植物茶(CamelliasinensisO.ktunze)的叶子经过加工制成,主要生长在亚洲、非洲和拉丁美洲的热带和亚热带地区[2]。研究表明茶叶具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌消炎、降脂减肥等功效[3-11]。茶叶中主要含有茶多酚、茶多糖、茶氨酸、咖啡因等化合物[12-15],其中茶多酚具有抗增殖和抗炎症的作用,能一定程度预防癌症、心血管、糖尿病等疾病的发生[16-19]。此外,茶叶还具有独特的香气与味道被广泛使用在食品、饮料和化妆品等领域[20-22]。茶叶的种类繁多,根据制作工艺的不同分为未发酵茶、半发酵茶及发酵茶等[23],如碧螺春、西湖龙井属于未发酵茶,大红袍与铁观音属于半发酵茶,遵义红茶属于全发酵茶[24-25]。又根据茶叶的外形、色泽、香气、净度等因素影响可划分为特级、一级、二级等多种等级[26-27]。目前,市场上审评茶叶的品种及品质优劣仍以感官为主,理化检验为辅,受主观因素影响较大,导致市场上茶叶质量参差不齐,缺乏可量化的标准[28]。

指纹图谱是指在固定的实验条件下将待测物经适当处理后得到的能标识其化学特征的谱图[29],指纹图谱具有整体性、可量化的特点,已被广泛应用于中药质量控制、食品评价、种子检测和鉴定等领域[30-34]。其中高效液相色谱(HPLC)指纹图谱可用于分析茶叶中的非挥发性成分[35-36],但应用多品种、多厂家、多等级茶叶的研究较少。本文运用高效液相色谱研究不同品种茶叶的指纹图谱并评价不同品种茶叶及同品种不同等级、不同厂家茶叶的差异,以期为茶叶的质量控制和科学应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

10个茶叶品种共33批茶叶样品(品种有湄潭翠芽、都匀毛尖、遵义红茶、铁观音、绿宝石、碧螺春、西湖龙井、凤岗锌硒茶、大红袍、天柱茶叶) 样品来源如表1所示;甲醇、乙腈 色谱纯,天津市科密欧化学试剂有限公司;磷酸 重庆川东有限公司;没食子酸(GC)、表儿茶素(EC) 中国药品生物制品鉴定所;表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG) 纯度≥98%,成都普菲德生物技术有限公司。

表1 茶叶样品来源

Agilent 1260高效液相色谱仪(PDA检测器) 安捷伦科技有限公司;AG135电子天平、AB265-S电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司;KQ-100E型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;800Y型多功能粉碎机 永康市铂欧五金制品有限公司;HH-4数显恒温水浴锅 上海浦东物理光学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 标准品溶液的制备 称取没食子酸10.76 mg、表儿茶素10.34 mg、表没食子儿茶素没食子酸酯10.00 mg、表儿茶素没食子酸酯10.26 mg分别用75%甲醇水溶解并配制成没食子酸0.2152 mg/mL、表儿茶素0.2068 mg/mL、表没食子儿茶素没食子酸酯0.8000 mg/mL、表儿茶素没食子酸酯0.5130 mg/mL的标准品溶液,分别取以上标准品溶液各0.2 mL定容到1 mL,摇匀即可。

1.2.2 供试品的制备 称取茶样粉末(过65目筛)0.5 g,置于100 mL圆底烧瓶中,加入75%甲醇水50 mL,加热回流提取2次,每次30 min,合并滤液并定容到100 mL,摇匀过0.22 μm微孔滤膜,备用。

1.2.3 色谱条件 流动相A为0.2%的磷酸水,流动相B为乙腈;色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),检测波长为280 nm,柱温30 ℃,流速1.0 mL/min,进样量10 μL。分析时间57 min。梯度洗脱方法:0～15 min,5%～10% B;15～32 min,10%～12% B;32～37 min,12%～18% B;37～44 min,18%～20% B;44～49 min,20%～22% B;49～57 min,22%～30% B。系统平衡色谱柱时间为10 min。

1.3 数据处理

将实验数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版进行相似度分析并建立不同品种茶叶指纹图谱,使用SPSS 19.0 软件进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 仪器精密度实验 取产自永兴茶叶生产基地的特级湄潭翠芽,按“1.2.2”项下的方法制备,在“1.2.3”项下的色谱条件下连续进样5次,进样量为10 μL,考察仪器的精密度。结果表明,各共有峰的相对保留时间及相对峰面积RSD均小于3%,说明仪器的精密度良好。

2.1.2 稳定性实验 取产自永兴茶叶生产基地的特级湄潭翠芽,按“1.2.2”项下的方法制备提取液,按“1.2.3”项下的色谱条件下分别于0、2、4、8、12、24 h进样,进样量为10 μL,考察茶叶提取液的稳定性。结果表明,各共有峰的相对保留时间与相对峰面积RSD均小于3%,说明茶叶提取液在24 h稳定。

2.1.3 重复性实验 取产自永兴茶叶生产基地的特级湄潭翠芽,按“1.2.2”项下的方法平行制备分析样品,按“1.2.3”项下的色谱条件分别进样,进样量为10 μL,考察实验方法的重复性。结果表明,各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3%,说明该方法的重复性良好。

2.2 指纹图谱的建立

称取33批茶叶样品各0.5 g,精密称量,按“1.2.2”项下的方法制备供试品,按“1.2.3”项下的色谱条件进样检测,提取不同茶叶样品在280 nm处的色谱图,导入中药指纹图谱相似度评价系统,进行色谱峰匹配,应用中位数法,时间窗宽度为 0.3,生成33批茶叶样品的HPLC指纹图谱及对照指纹图谱,见图1～图2,并标定5个共有峰,确认了其中没食子酸(1号峰)、表儿茶素没食子酸酯(10号峰)、表没食子儿茶素没食子酸酯(14号峰),见图3。按照上述方法,建立同一品种不同等级、厂家茶叶指纹图谱,即湄潭翠芽不同厂家、等级的HPLC指纹图谱(图4)、凤岗锌硒茶不同厂家、等级的HPLC指纹图谱(图5)、铁观音不同厂家、等级的HPLC指纹图谱(图6)、遵义红茶不同等级的HPLC指纹图谱(图7)、都匀毛尖不同等级的HPLC指纹图谱(图8)、绿宝石不同等级的HPLC指纹图谱(图9),选择含量相对较高、性质较稳定、保留时间居中、峰形好且有较好的分离度及在各样品中均存在的7号峰为参照峰S,其保留时间和峰面积为 1,并计算其他各共有峰的相对保留时间和相对峰面积,见表2～表3。

表2 不同茶叶样品HPLC指纹图谱共有峰的相对保留时间(min)

续表

图8 都匀毛尖不同等级的HPLC指纹图谱

表3 不同茶叶样品HPLC指纹图谱共有峰的相对峰面积(mAU)

续表

图1 33批茶叶样品的HPLC指纹图谱

图9 绿宝石不同等级的HPLC指纹图谱

图2 33批茶叶对照指纹图谱

图3 混合标准品HPLC色谱图

图4 湄潭翠芽不同厂家、等级的HPLC指纹图谱

图5 凤岗锌硒茶不同厂家、等级的HPLC指纹图谱

图6 铁观音不同厂家、等级的HPLC指纹图谱

图7 遵义红茶不同等级的HPLC指纹图谱

2.3 相似度评价

2.3.1 不同品种茶叶的相似度评价 将33批茶叶样品的HPLC色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A 版》软件中,应用中位数法,时间窗宽度为0.3,生成对照指纹图谱并对其进行编号,测得样品与对照指纹图谱之间的相似度,不同品种茶叶相似度在0.681～0.999,见表4。

表4 33批茶叶样品的相似度

2.3.2 各品种不同等级、不同厂家茶叶相似度评价 湄潭翠芽不同等级、不同厂家的相似度在0.968～0.998;凤岗锌硒茶不同等级、不同厂家的相似度在0.987～1.000;铁观音不同等级、不同厂家的相似度在0.974～0.996;不同等级的遵义红茶相似度在0.989～1.000;不同等级都匀毛尖相似度在0.989～1.000;不同等级绿宝石相似度在0.996～1.000。结果显示同品种不同等级、不同厂家茶叶相似度较高,说明同一品种不同等级及不同厂家茶叶的品质较为接近,茶叶品质差异较小,其茶叶品质的差异主要取决于原料及制作工艺等因素的影响,结果见表5～表10。

表5 湄潭翠芽不同等级、不同厂家的相似度

表6 凤岗锌硒茶不同等级、不同厂家的相似度

表7 铁观音不同等级、不同厂家的相似度

表8 遵义红茶不同等级的相似度

表9 都匀毛尖不同等级的相似度

表10 绿宝石不同等级的相似度

2.4 共有峰的确定

2.4.1 不同茶叶样品共有峰的确定 取各品种不同厂家、不同等级茶叶共33批茶样品进行实验并测定其结果,综合33批样品的色谱图(图1),有5个共有峰,分别为1、2、7、10、14号峰,其中确认1号峰为没食子酸,10号峰为表儿茶素没食子酸酯,14号峰为表没食子儿茶素没食子酸酯,且各批茶叶样品的5个共有峰总面积占总峰面积的80%以上。此外,还确认9号峰为表儿茶素。西湖龙井有15个共有峰,湄潭翠芽有14个共有峰,天柱茶叶有14个共有峰,凤岗锌硒茶有13个共有峰,都匀毛尖有13个共有峰,绿宝石有12个共有峰,碧螺春有12个共有峰,大红袍有11个共有峰,遵义红茶有8个共有峰、铁观音有8个共有峰,各品种共有峰个数差异较大,说明不同品种茶叶成分差异大。

2.4.2 不同品种茶叶间共有峰的比较 从共有峰上发现,西湖龙井、天柱茶叶及湄潭翠芽之间比较有13个共有峰,共有峰数目较多,提示这三种茶叶成分可能更为接近。都匀毛尖、凤岗锌硒茶、绿宝石及碧螺春之间比较有11个共有峰,西湖龙井、天柱茶叶、湄潭翠芽与都匀毛尖、凤岗锌硒茶、绿宝石及碧螺春比较有10个共有峰,大红袍及铁观音之间比较有8个共有峰,大红袍、铁观音与西湖龙井、天柱茶叶、凤岗锌硒茶、湄潭翠芽、都匀毛尖、绿宝石及碧螺春之间有6个共有峰,遵义红茶与西湖龙井、天柱茶叶、凤岗锌硒茶、湄潭翠芽、都匀毛尖、绿宝石及碧螺春之间有7个共有峰,遵义红茶与大红袍及铁观音比较有5个共有峰,其共有峰数目减少,提示以上几种茶叶相似度虽高,但在茶叶成分上有差异。

2.5 指纹图谱聚类分析

采用SPSS软件对33个茶样品共有峰的相对峰面积进行聚类分析(图10),在标度为11时,可分为3类,即湄潭翠芽(S1～S9)、凤岗锌硒茶(S10～S15)、都匀毛尖(S16～S18)、碧螺春(S27)、西湖龙井(S29)、天柱茶叶(S30)及绿宝石(S31～S33)聚为一类,大红袍(S28)与铁观音茶(S22～S26)聚为一类,遵义红茶(S19～S21)聚为一类,茶叶根据制作工艺的不同可分为未发酵茶、半发酵茶及全发酵茶等[23],湄潭翠芽、凤岗锌硒茶、都匀毛尖、碧螺春、西湖龙井、天柱茶叶属于未发酵茶,大红袍与铁观音属于半发酵茶,遵义红茶属于全发酵茶[24-25]。因此,通过对33批茶样品进行聚类分析,可以区分发酵茶、半发酵茶及未发酵茶三种不同制作工艺的茶叶。

图10 33批次茶叶样品指纹图谱聚类分析

3 讨论与结论

本研究采用 HPLC 指纹图谱结合相似度评价对不同品种茶叶、不同厂家茶叶、不同等级茶叶进行分析,除遵义红茶外,其余茶叶中均含有表儿茶素,有5个共有峰,其中确认了没食子酸、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯3个共有峰,且不同品种茶叶的相似度为0.681～0.999,不同品种茶叶相似度较低、共有峰个数差异大,提示不同品种茶叶间可能有较大差异,其中,遵义红茶的相似度最低为0.681。红茶属于全发酵茶,根据制作工艺的不同可将茶叶分为未发酵茶、半发酵茶及全发酵茶等[23]。不同制作工艺会使其化学成分遭到破坏,且茶多酚会不同程度被降解,如半发酵茶会破坏茶叶中的叶绿素,其茶多酚含量较未发酵茶叶中的低[37-38]。遵义红茶相似度低可能与其是全发酵茶有关。此外,对于同品种、不同等级、不同厂家的茶叶进行研究,发现各个品种茶叶相似度在0.968～1.000,表明同一品种不同等级及不同厂家茶叶的品质较为接近,茶叶品质差异较小,其茶叶品质的差异主要取决于原料及发酵工艺等因素的影响。

对于33茶叶样品进行聚类分析,结果表明,在标度为11时即分为3类,湄潭翠芽、凤岗锌硒茶、都匀毛尖、碧螺春、西湖龙井、天柱茶叶及绿宝石为一类,大红袍与铁观音茶为一类,遵义红茶为一类,其聚类结果与相似度分析结果基本一致。因此,通过对33批茶样品进行聚类分析,可以区分发酵茶、半发酵茶及未发酵茶三种不同发酵工艺的茶叶。本实验通过建立不同品种茶叶HPLC指纹图谱并结合聚类分析方法,可区分发酵茶、半发酵茶及未发酵茶三种不同制作工艺的茶叶,并评价不同品种茶叶及同品种不同等级、不同厂家茶叶品质的差异,可为茶叶的质量控制和科学应用提供参考依据。