DNA条形码技术在陕西省鼠形动物鉴定中的应用

陈宝宝，孙养信，范锁平，吕 文，聂守民，李胜振，安翠红

鼠形动物主要包括啮齿目、兔形目和食虫目[1], 外型类似鼠类，是鼠疫、流行性出血热、钩端螺旋体病等多种自然疫源性疾病的储存宿主和传播者，可通过体外寄生虫叮咬、排泄物污染或直接咬人传播疾病，严重危害人类健康，造成巨大经济损失。了解疫源地鼠形动物的种类和数量对于鼠传疾病的防治有重要作用，而快速准确地识别宿主动物是传染病现场防控工作的首要任务。DNA 条形码技术开创了物种鉴定新时代，目前已在多种动物中得到证实，其不仅在鉴别物种方面快速准确, 而且在幼残体鉴定、区分近缘种、发现隐存种等方面具备绝对优势[2-6]。陕西省地处我国西北地区东部,南有秦巴山地，北有黄土高原，其间夹有渭河关中平原，按照地理环境可以分为陕北、关中、陕南3部分。陕北地区地貌为黄土高原丘陵沟壑区和沙漠生境，关中地区属渭河平原地带，陕南属秦巴山地生境[7-8]。由于自然环境复杂，景观多样，有多种鼠形动物，2012—2018年，结合鼠疫监测工作，对陕西省鼠形动物的分布、种群组成进行了调查, 同时，基于线粒体 COI 基因进行分析，积累我省鼠形动物DNA条形码数据，探索利用 DNA 条形码鉴别鼠形动物的可行性。

1 材料与方法

1.1标本采集 2012—2018年，结合鼠疫监测工作，选择全省22个县(区)作为调查点，使用样方法、5 m夹笼法、夹夜法采集鼠形动物标本，不同地区方法不同，所有标本形态学初步鉴定后无菌采集少许肝脏保存于无水乙醇中备用。

1.2DNA的提取 根据QIAGEN DNAeasy试剂盒提取步骤制备所有收集鼠形动物的DNA模板。

1.3COI基因的扩增 首先选用通用引物BatL5310/ R6036R扩增COI基因，当通用引物扩增反应失败时, 则选用鸡尾酒引物，引物序列、PCR反应体系及条件参照参考文献[6]。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析，若电泳图中出现目标条带即送样测序。引物序列合成及测序均由西安某生物公司完成。

1.4COI基因序列分析 测序结果首先观察峰图质量, 如较差则重新扩增和测序。将测定序列在美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站上运行BLAST核酸序列同源性检索。运用Mega 6软件比对各基因序列的碱基组成和变异,基于Kimura-2-parameter(K2P) 模型计算各物种的遗传距离；采用Neighbor-Joining(NJ)邻接法构建系统树[9]。

2 结 果

2.1COI基因的获得 在全省陕北、关中、陕南地区的22个县(区)调查点总计获得709只鼠形动物的COI基因序列，隶属于3目10科24属38种，种属分类标准参照王应祥[10](2003)《哺乳动物分类名录》。序列经NCBI同源性检索，除显孔攀鼠、甘肃仓鼠、猪尾鼠及麝鼹4种鼠形动物未找到相应序列以外，其余均与NCBI中相应序列的同源性在97%以上(表1)。

2.2形态学鉴定结果的纠正 基于外部形态特征的初步鉴定, 经COI基因序列分析发现，有部分标本鉴定有误，例如秦巴山区部分标本形态学鉴定为大林姬鼠, 但与高山姬鼠的相似度在97%以上，确定为高山姬鼠；南郑、宁陕部分黄胸鼠与褐家鼠的鉴定混淆；镇坪捕获的3只鼩鼱，形态学无法鉴定种，分子鉴定发现，其中1只COI基因序列与另外2只的遗传距离在22%左右，经NCBI比对，与黑齿鼩鼱的相似度为97%，确定为黑齿鼩鼱，另外2只与鼩鼹属的相似度为93%，确定为鼩鼹属，但因NCBI缺少相关数据，还有待进一步确定到种。采集的黄鼠最初判定为达乌尔黄鼠，经NCBI比对均为阿拉善黄鼠，鼠兔形态学鉴定认为是达乌尔鼠兔，分子鉴定与青海间颅鼠兔相似度更高。

2.3COI基因序列分析 对获得的709条COI基因序列在不同科、属、种范围内进行序列分析，结果显示啮齿目5科之间的遗传距离为18.2%～30.4%，其中鼠科7个属之间的遗传距离为14.4%～21.5%，姬鼠属种间遗传距离为6.5%～16.4%，中华姬鼠与其他两种姬鼠的遗传距离较大，在14.7%～16.4%之间；仓鼠科属间遗传距离为14.8%～22.5%，仓鼠属种间遗传距离在7.2%～14.4%之间。食虫目、兔形目科间遗传距离分别为23.3%～27.2%、23.4%～24.2%之间。所有样本的种内遗传距离均在3.6%以内, 平均为1.4%，种间遗传距离大于5.6%, 属间、科间遗传距离界限不明显(图1)。

图1 陕西省鼠形动物COI基因序列遗传距离差异分析Fig.1 Analysis of genetic distance on COI gene sequence of Shaanxi Province

表1 鼠形动物种类、来源及COI基因序列同源性比对结果
Tab.1 Species, sources and homology comparison results of COI gene of samples

目科属种来源数量参考序列相似度(%)啮齿目Rodentia鼠科Muridae家鼠属Rattus黄胸鼠R. tanezumi石泉、南郑、宁强、佛坪、周至、宁陕48KF011916.1≥99褐家鼠R.norvegicus石泉、南郑、定边、宁陕、神木、镇坪38KM820832.1≥99大足鼠R.nitidus南郑、宁强、佛坪、山阳、宁陕、镇坪21NC_040919.1≥98白腹鼠属Niviventer针毛鼠N.fulvescens宁强、宁陕、山阳、镇巴13KP455488.1≥99社鼠N.confucianus眉县、南郑、宁强、太白、柞水、佛坪、凤县、山阳、宁陕、周至、镇坪、镇巴71KJ152220.1≥99安氏白腹鼠N. andersoni镇巴1KU531772.1≥99长尾巨鼠属Leopol-damys白腹巨鼠L.edwardsi南郑1KP995204.1≥99攀鼠属Vernaya显孔攀鼠V. foramena镇巴1 ─ ─小鼠属Mus小家鼠M.musculus石泉、府谷、定边、宁陕、榆阳16LC228857.1≥99巢鼠属Micromys巢鼠M.minutus宁陕1KP399599.1≥99姬鼠属Apodemus中华姬鼠A.draco眉县、南郑、太白、柞水、佛坪、宁陕、山阳、周至、镇坪49HQ333255.1≥99黑线姬鼠A.agrarius眉县、南郑、宁强、太白、凤县、黄龙、宁陕、镇巴34KY851957.1≥99高山姬鼠A.chevrieri南郑、太白、柞水、佛坪、凤县、山阳、周至、宁陕、镇巴96KF999112.1≥97仓鼠科Circetidae仓鼠属Cricetulus黑线仓鼠C.Barabensis大荔、凤县5KX882054.1≥97中国仓鼠C. griseus定边(形态学鉴定为黑线仓鼠)2EF568628.1100索氏仓鼠C.sokolovi靖边、定边(形态学鉴定为黑线仓鼠)70KJ466858.1≥98长尾仓鼠C.longicau-datus榆阳、府谷7KM067270.1≥97大仓鼠C.tritonde大荔、榆阳5EU031048.1≥98甘肃仓鼠属Cansumys甘肃仓鼠C.canus宁陕、山阳4─ ─毛足鼠属Phodopus小毛足鼠P.Rborovskii定边、榆阳、靖边19KU885975.1≥99绒鼠属Eothenomys黑腹绒鼠E.melano-gaster镇坪3KP997311.198绒属Caryomys洮州绒鼠C. eva眉县2HM165358.197苛岚绒鼠C.inez宁陕、凤县、佛坪、山阳6KU200225.199田鼠属Microtus棕色田鼠M. mandari-nus大荔4JX014233.198东方田鼠M. fortis定边2JF261174.199

表1(续)

表1(续)目科属种来源数量参考序列相似度(%)沙鼠属Meriones子午沙鼠M.meridia-nus定边、大荔、府谷、榆阳29KR013227.1≥99长爪沙鼠M. unguicu-latus定边43KF425526.1≥99刺山鼠科Platacanthomyi-dae猪尾鼠属Typhlomys猪尾鼠T.cinereus镇巴1─ ─跳鼠科Dipodidae五趾跳鼠属Allactaga五趾跳鼠A.sibirica定边2KC193065.198三趾跳鼠属Dipus三趾跳鼠D.sagitta府谷、靖边、定边、榆阳27KX399540.199松鼠科Sciuridae黄鼠属Spermophilus阿拉善黄鼠S.alas-chanicus定边、吴起、靖边、大荔、府谷39KM537979.199兔形目Lagomorpha鼠兔科Ochotonidae鼠兔属Ochotona间颅鼠兔O. cansus定边、吴起(形态学鉴定为达乌尔鼠兔)12KT805364.199兔科Leporidae兔属Lepus草兔L. capensis定边2GU937113.199食虫目Insectivora 鼩鼱科Sorici-dae微尾鼩属Anourosorex四川短尾鼩A. squa-mipes镇坪、镇巴、太白、南郑30KJ545899.199短尾鼩鼱属Blarinella 黑齿鼩鼱B.quadrati-cauda镇坪1KJ131179.197鼹科Talpidae麝鼹属Scaptochirus麝鼹S. moschatus定边1─ ─鼩鼹属Uropsilus鼩鼹U. soricipes镇巴1KP245954.197待定种Uropsilus. sp镇坪(形态学鉴定为鼩鼱)2KP245954.193合计709

注：“─”表示NCBI GenBank中未找到相应序列。

2.4系统树构建及可能存在的隐种 从图2可以看出，所有样本分成40个高支持度的单一分支，高山姬鼠、黑线仓鼠分支内出现了高支持率的小支系, 高山姬鼠小分支内个体间遗传距离为0%～1.1%, 而分支间个体之间的遗传距离在2.8%～3.6%之间，遗传距离数值处于种内遗传距离与种间遗传距离的边缘。黑线仓鼠小分支内个体间遗传距离在1.7%以内, 分支间遗传距离差异较大，在7.3%～10.2%之间，通过与国内其他地区的仓鼠比较分析显示，大荔、凤县境内采集的为黑线仓鼠(C.Barabensis)，定边县境内采集的有2种，分别为索氏仓鼠(C.sokolovi)和中国仓鼠(C.griseus)，其他地区采集的均为索氏仓鼠。

3 讨 论

陕西省自然环境复杂，鼠形动物物种丰富，王廷正等[7]记载的陕西省啮齿动物啮齿目、兔形目总计11科55种，其中啮齿目52种，兔形目3种。王应祥[10]在《中国哺乳动物物种和亚种分类名录与分布大全》中记载的陕西分布的食虫目有16种，兔形目有3种。对鼠形动物准确分类和科学防治是预防和控制多种传染病的基础。动物线粒体 DNA结构简单、呈母系遗传且进化速度快，是研究种间分子进化和系统发育最佳选择。基于线粒体COI基因的 DNA 条形码分子分类方法克服了传统形态学分类存在的缺陷，成为生物分类学研究中的研究热点。

我省从2011年开始将DNA条形码技术应用到鼠种鉴定中，2012年应用该技术首次在定边县鼠疫疫区鉴定出东方田鼠[11]，2014年对7个鼠种8个不同部位的62份残体标本扩增的COI基因比对结果与形态学鉴定相吻合[12-13]；2015年通过与宁夏、内蒙黄鼠COI基因序列比对发现，我省黄鼠与宁夏阿拉善黄鼠的遗传距离≤0.5%,与内蒙达乌尔黄鼠遗传距离在7.9%～9.3%之间, 从而将我省多地分布的达乌尔黄鼠更名为阿拉善黄鼠[14-16]。

图2 基于COI基因部分样本的NJ系统发育树Fig.2 A neighbor-joining phylogenetic tree of partial samples based on COI gene

Hebert等[17]对动物界13 320个物种的COI基因序列比较分析发现，98%的物种种内差异在0%～2%；平均种间差异为11.3%。马英等[6]对青海省110只小型兽类COI基因序列分析显示,种内遗传距离≤3%, 种间遗传距在5%～10%之间, 属间为12%～19%。本研究对陕西省境内捕获的709份鼠形动物COI基因进行扩增分析，在不同科、属、种范围内分析其遗传距离差异，结果显示所有样本的种内遗传距离均在3.6%以内, 平均为1.4%，种间遗传距离大于5.6%, 与上述研究结果基本吻合；属间、科间遗传距离界限不明显，但种间遗传距离显著大于种内遗传距离，而种内和种间遗传距离的大小是进行物种间鉴定的重要标志，较大的种间差异是对物种进行准确鉴定的先决条件[18]，说明基于COI 基因序列的 DNA 条形码技术能够对多种鼠形动物进行有效的物种鉴定。

DNA条形码技术在区分近缘种、发现隐存种等方面有一定的优势。从系统发育树可以看出，所有样本分成40个高支持度的单一分支，高山姬鼠、黑线仓鼠分支内出现了高支持率的小支系, 经个体间遗传距离分析，高山姬鼠分支之间数值(2.8%～3.6%)处于种内遗传距离与种间遗传距离的边缘，由于样本采自不同的监测点，是否是因生境的差异性造成的遗传距离较大，还是属于2个种，有待进一步确认。而黑线仓鼠分支间遗传距离差异较大，进一步分析显示，属于不同的种，分别为黑线仓鼠、索氏仓鼠和中国仓鼠。同时，通过序列的同源性比较，分析发现，我省的鼠兔为间颅鼠兔而非达乌尔鼠兔， 后续将通过模式标本的形态学数据加以印证。

当然，DNA条形码技术还存在一些不足之处，DNA条形码数据库还在进一步的完善中，不是所有的鼠形动物都能找到完全相匹配的数据，而且，不同类群内物种间由于环境等因素的影响，遗传距离可能不同, 而现有DNA条形码数据积累的物种判断阈值可能对物种多样性造成一定的误判。传统分类学是生物多样性研究和保护的基础，因此，应将传统的分类学鉴定方法和现代分子生物学鉴定方法结合，以保证结果的准确可靠性。

利益冲突：无