新布尼亚病毒真核表达载体的构建及表达

窦丽丽，陶晓莉，王晓芳，李婷婷，李永刚

近年来，我国新发现了一种新型布尼亚病毒，经蜱传播，其临床表现主要为发热、血小板和白细胞减少、胃肠道症状以及淋巴结肿大，严重时还会引起器官衰竭，故将此病毒命名为发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒，该病毒引起的疾病称为严重发热伴血小板减少症(SFTS)，是一种人兽共患病[1]。该病毒被世界卫生组织列为引起严重发热的最危险病原体,其死亡率为12%～30%，同时伴有特征性血小板减少症[2]。然而，目前还没有针对此种病毒的抗病毒药物或者疫苗，另外该病毒在人类中的发病机制及病毒与宿主的相互作用在很大程度上仍未可知[3]。布尼亚病毒是最大的动物病毒家族之一，大约有350种病毒，其中大多数是虫媒病毒，由节肢动物或啮齿动物传播。不同的布尼亚病毒感染者表现出一系列轻度至重度疾病，即发热性疾病，脑炎，出血热和急性呼吸道疾病[1]。 由于宿主的广泛性和物种的多样性，布尼亚病毒引起了广泛的关注。

研究表明，SFTSV-NSs是一个强的干扰素(IFN)拮抗剂，其可以阻断SFTSV感染细胞中IFN生成并且NSs是病毒毒力的主要决定因素[4-9]。一些专家学者尝试产生缺乏NSs结构的缺陷型病毒以促进该发病机理的研究及开发新的候选疫苗，以防止这种重要的新兴病原体的传播。NSs在SFTSV病毒复制周期中具有重要作用，而该病毒在人类中的发病机制及病毒与宿主的相互作用仍不十分明确，本研究通过克隆SFTSV-NSs基因，构建其真核表达质粒以及检测其在细胞中的表达，为进一步研究SFTSV-NSs基因的结构和功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

1.1.1病毒与细胞 本实验所用的SFTSV由中国医学科学院微生物所馈赠，293细胞株购于北京协和医学院细胞中心。

1.1.2主要试剂 内切酶EcoRI酶、XhoⅠ酶(Thermo Scientific)；反转录试剂盒、DH5α感受态细胞等(TaKaRa 公司)；TRIzol Reagent LS(Ambion)；质粒DNA中量试剂盒(美国Axyprep公司);DMEM培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)；抗FLAG单克隆抗体(Sigma公司)；Alexa Flour 594 goat anti-mouse IgG (H+L)、HRP-goat anti-mouse IgG (H+L) (Invitrogen公司)等。

1.2 SFTSV-NSs基因真核表达载体的构建

1.2.1引物设计与合成 根据GenBank提供的SFTSV-NSs序列，运用Premier 5.0软件，进行引物的设计。设计引物时，选取合适的酶切位点，设计真核表达重组质粒的引物见表1。

表1 新布尼亚病毒SFTSV-NSs基因真核表达引物
Tab.1 Eukrainian virus SFTSV-NSs gene eukaryotic expression primer

名称序列产物长度/bpSFTSV-NSs R(BamHI)CGGGATCCTTAGACCTCCT-TCGGGAGGTCACCAATG877SFTSV-NSs F(EcoRI)CGGGATCCTTAGACCTCCT-TCGGGAGGTCACCAATG877

注：设计好的引物由大连宝生物公司合成，纯化级别为PAGE级。

1.2.2SFTSV RNA的提取及SFTSV-NSs基因PCR 扩增 SFTSV RNA按照Invitrogen公司的TRIzol Reagent LS 试剂说明书进行的提取，后经反转录合成病毒cDNA。通过PCR 扩增得SFTSV-NSs基因。PCR 程序为94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸65 s，扩增35个循环; 72 ℃ 延伸10 min。PCR扩增产物通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3重组质粒pSFTSV-NSs-FLAG构建和鉴定

将PCR扩增产物进行通过纯化试剂盒进行纯化，并取适量PCR纯化产物送去公司测序。将纯化得到的SFTSV-NSs cDNA 片段连接到pFLAG-CMV-3载体，将连接产物转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞选择生长良好的单克隆扩大培养后进行质粒中量提取，并用分光光度仪测定提取的质粒浓度，将提取的重组质粒用EcoRI/BamHI进行双酶切鉴定。

1.3pSFTSV-NSs-FLAG转染人肾上皮细胞293及相关检测

1.3.1293细胞培养及转染 将293细胞以4×105/孔的密度接种到置有爬片的24孔板中，加入配好的含10%胎牛血清的高糖培养基置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养过夜。次日每孔用50 μL Opti-MEM稀释2 μL PEI转染试剂，轻轻吹吸3～5次混合均匀，室温放置5 min。用50 μL Opti-MEM稀释pSFTSV-NSs-FLAG质粒0.8 μg，同时稀释空载体pFLAG-CMV-3设置为对照组；将稀释好的质粒与空载体分别加入到PEI稀释液中，室温放置20 min。将混合液逐滴加入到24孔板中，置于37 ℃细胞培养箱中培养48 h。分别进行间接免疫荧光及Western Blot检测。

1.3.2免疫荧光检测 293细胞转染pSFTSV-NSs-FLAG质粒48 h后，用4%多聚甲醛固定液固定1 h，PBS洗涤3次。然后0.1% Triton X-100打孔10 min，用PBS洗涤3次后再加入含2% FBS的PBS封闭液，4 ℃封闭2 h。用PBS洗涤3次后加入小鼠抗FLAG抗体，37 ℃孵育1 h。吸掉一抗稀释液，用PBS洗涤3次，加入二抗Alexa Flour 594 goat anti-mouse IgG (H+L)，37 ℃孵育1 h，PBS洗涤3次，每孔加入100 μL DAPI溶液室温孵育5 min，PBS洗涤3次，用甘油进行封片，共聚焦显微镜下观察。

1.3.3Western blot检测重组质粒转染的293细胞中SFTSV-NSs蛋白表达 用细胞裂解液NP-40提取转染后293细胞的总蛋白，加入 4×蛋白上样缓冲液置于沸水浴中加热10 min进行蛋白变性，所得样本收集置于-20 ℃冻存备用。蛋白样品回收后转膜，5% 脱脂奶粉封闭2 h; 将小鼠抗FLAG抗体用1∶5 000比例稀释，4 ℃ 摇床孵育过夜; 然后用洗膜液5 min/次洗膜3次。再以1∶3 000的比例稀释HRP-goat anti-mouse IgG (H+L)作为二抗，室温摇床孵育1 h，再用洗膜液5 min/次洗膜3次。最后用化学发光法分别检测PVDF膜上SFTSV-NSs蛋白的表达。

2 结 果

2.1SFTSV-NSs基因扩增序列测定 PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图1，在877 bp左右有条带，与预期SFTSV-NSs基因大小一致，因此判断SFTSV-NSs真核表达基因扩增成功，且条带单一，可以进行PCR产物纯化。

注：1和2均为SFTSV-NSs目的片段图1 SFTSV-NSs基因PCR产物电泳结果Fig.1 SFTSV-NSs gene PCR product electrophoresis results

2.2重组质粒构建及测序鉴定 用EcoRI/BamHI双酶切真核PCR纯化产物和空载体pFLAG-CMV-3质粒，回收目的片段并连接，用EcoRI/BamHI双酶切鉴定。电泳显示有和预期大小一致的酶切片段，证明pSFTSV-NSs-FLAG质粒构建成功，见图2。

注：1和2均为pSFTSV-NSs-FLAG质粒图2 EcoRI/BamHI双酶切pSFTSV-NSs-FLAG质粒Fig.2 EcoRI/BamHI double digestion of pSFTSV-NSs-FLAG plasmid

2.3免疫荧光检测SFTSV-NSs基因在293细胞中的定位 pSFTSV-NSs-FLAG转染至293细胞中，以抗FLAG标签的单克隆抗体为一抗进行间接免疫荧光检测。结果如图3所示，转染的293细胞质内检测到荧光聚集的类包涵体样结构，但细胞核内无表达；而转染pFLAG-CMV-3空载体的细胞未检测到荧光标记。

注：A为转染空载体pFLAG-CMV-3；B为转染重组质粒pSFTSV-NSs-FLAG图3 pSFTSV-NSs-FLAG转染细胞间接免疫荧光检测(200×)Fig.3 Indirect immunofluorescence detection of pSFTSV-NSs-FLAG transfected cells (200×)

2.4Western blot 鉴定目的蛋白在293细胞中的表达 pSFTSV-NSs-FLAG转染至293细胞中，Western Blot检测结果如图4所示。由图可见pSFTSV-NSs-FLAG转染后的细胞提取总蛋白的泳道中在约33 kD处有特异性条带出现，与SFTSV-NSs蛋白预期大小一致，而转染空载体pFLAG-CMV-3的泳道则没有条带。

注：1为转染空载体；2-4为转染pSFTSV-NSs-FLAG质粒图4 pSFTSV-NSs-FLAG转染细胞Western Blot检测Fig.4 pSFTSV-NSs-FLAG transfected cells were detected by Western Blot

3 讨 论

布尼亚病毒之所以种类繁多，是由于其基因组的分节段特性，利于病毒发生基因重排和基因重组，既可对变化的环境获得适应性突变，也可快速产生新病毒，增加致病性。基因重排和基因重组本质上增大了布尼亚病毒对宿主的危害，为布尼亚病毒诊断、预防及控制加大了难度，从而对人类公共卫生造成了更大的威胁[10-12]。因此，对重要的布尼亚病毒要求进行深入研究，探究其遗传机制、传播机制及驱动基因重排的机理，从而为此类病毒的预防与控制提供理论基础。

SFTSV属于布尼亚病毒科白蛉病毒属，为分节段的负链RNA病毒，病毒颗粒呈球形，直径80～100 nm，由厚度5～7 nm的脂质双层覆盖，其表面有棘突。与其他白蛉属病毒类似，SFTSV基因组分为L、M、S 3个片段，S片段编码核蛋白(NP)和非结构蛋白(NSs)[13]。Brennan B等[14]发现SFTSV病毒致病性的增强是由于NSs对先天免疫反应的拮抗作用，并且他们进一步证实编码NSs核苷酸序列的某些部分对于重组病毒的回收可能是至关重要的。在体内环境中，SFTSV-NSs拮抗IFN反应的能力可能限于I型干扰素诱导和信号传导。NSs蛋白可以在感染和转染的细胞中形成病毒样结构(VLS),受感染细胞中的结构蛋白可能与病毒RNA相互作用[15]。本研究通过转染构建的病毒重组质粒，经免疫荧光检测也观察到类包涵体样结构，与其研究结果一致。以上数据表明NSs也可能在病毒复制中发挥重要作用[17]。另外，有研究表明，NSs蛋白可能在病毒复制中发挥重要作用，但具体作用机制尚不清楚。本研究通过构建SFTSV-NSs真核表达体 pSFTSV-NSs-FLAG并将其转染293细胞，进而通过研究重组质粒在细胞中的表达情况，为进一步研究SFTSV-NSs基因的结构和功能奠定基础，以期为研究SFTSV在感染细胞过程中与宿主的相互作用提供新思路。

利益冲突：无