响应面法优化超声波辅助提取侧柏叶总黄酮工艺

王树宁，宋照军，黄滢洁，赵功玲，梁新红，刘本国

（河南科技学院食品学院，河南新乡453003）

侧柏叶是柏科植物侧柏的干燥嫩枝梢及叶，具有凉血止血，生发乌发，祛风降湿，化痰止咳，消肿散毒的功效[1-2]。侧柏叶中含有多种活性物质，主要是类黄酮、挥发油以及鞣质等，其中黄酮类的含量较为丰富[3-4]，且被认为是主要功能成分之一，其功效已引起许多科研工作者的关注[5-7]。现代药理学证明，黄酮具有抑菌消炎、抗肿瘤、抗氧化、止血以及生发乌发等作用[8-12]。

近年来关于侧柏叶的研究主要集中在黄酮类的检测及应用，研究证实侧柏叶中黄酮的主要成分为芦丁、槲皮素、杨梅素及穗花杉双黄酮等[13-15]。目前国内广泛采用溶剂法提取侧柏叶中的活性成分[16-17]，但操作繁琐、耗时耗能、提取率低。超声波辅助提取技术具有高效、稳定、节能等优点，与传统的提取方法相比，提取时间短，提取效率高，深受人们欢迎[18]。本试验通过超声波对侧柏叶进行处理，通过单因素试验考察超声波时间、超声波温度以及超声波频率对黄酮得率的影响，采用响应面法优化最佳提取工艺，为工业化生产黄酮类化合物提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

侧柏叶：安徽亳州惠民中药材批发商行；芦丁标准品（纯度＞99%）：北京世纪奥科生物技术有限公司；乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠（均为国产分析纯）：山东西亚化学工业有限公司。

1.2 仪器设备

KQ-100DB 型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；FA224 型电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；720 型分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 侧柏叶干粉的制备

清洗、晾干侧柏叶，放置于60 ℃的烘箱中烘干4 h，用粉碎仪粉碎，过60 目筛，备用。

1.3.2 标准曲线的绘制

用芦丁作标准品[19]，采50 %的乙醇配制浓度为0.2 mg/mL 的芦丁标准品溶液。吸取芦丁标准品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，于 25 mL 的比色管中，各加入5%的亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，再各加10%的硝酸铝溶液1 mL，摇匀，加1 mol/L 的氢氧化钠10 mL，加50%乙醇至刻度，摇匀，放置10 min，于510 nm 下测定吸光度，绘制标准曲线，并计算回归方程。

1.3.3 样品中黄酮的提取及测定

称取侧柏叶干粉1 g，加入50%的乙醇溶液20 mL。利用超声波辅助提取黄酮，过滤提取液，滤渣再加入50%的乙醇20 mL 再提取一次，合并滤液，记录总体积数，为样品溶液。取样品溶液5 mL，置于25 mL 的比色管中，按1.3.2 中方法操作，测定样品中黄酮含量，按公式（1）所示计算黄酮得率。

式中：C 为依据回归方程计算的样品中黄酮含量，（mg/mL）；5 为为测定用样品滤液体积，mL；V 为样品滤液总体积，mL；M 为为侧柏叶质量，g。

1.4 单因素试验设计

1.4.1 超声波时间对黄酮得率的影响

称取7 份1 g 的侧柏叶干粉，加入50%的乙醇溶液20 mL，在超声波温度60 ℃，超声波频率50 kHz，分别超声波处理 10、20、30、40、50、60、70 min，提取黄酮，考察不同超声波时间对黄酮得率的影响。每个试验重复3 次。

1.4.2 超声波温度对黄酮得率的影响

称取7 份1 g 的侧柏叶干粉，加入50%的乙醇溶液20 mL，固定超声波时间50 min，超声波频率50 kHz，分别在 20、30、40、50、60、70、80 ℃超声波下提取黄酮，考察不同超声波温度对黄酮得率的影响。每个试验重复3 次。

1.4.3 超声波频率对黄酮得率的影响

称取7 份1 g 的侧柏叶干粉，加入50%的乙醇溶液 20 mL，设置超声波频率 7 个水平：20、30、40、50、60、70、80 kHz，固定超声波时间 50 min，超声波温度60 ℃，考察不同超声波频率对黄酮得率的影响。每个试验重复3 次。

1.5 响应面试验设计

根据单因素试验结果，设计三因素三水平的响应面试验，以黄酮得率为响应值，确定超声波法提取侧柏叶黄酮的最佳工艺条件，如表1 所示。

表1 响应面试验设计因素与水平Table 1 Design factors and level of response surface test

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到标准曲线，如图1 所示。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Rutin standard curve

式中：A 为吸光度；C 为芦丁的浓度，（μg/mL）。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 超声波时间对黄酮得率的影响

超声波时间对黄酮得率的影响见图2。

图2 超声波时间对黄酮得率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on the yield of flavonoids

由图2 可知，随超声时间的延长，黄酮得率逐渐上升，在50min 时达到最大值，其值为（25.830±0.065）mg/g，随着时间继续增加，黄酮得率下降，超声处理时间为70 min 时，黄酮得率下降至（24.220±0.065）mg/g。超声时间过短，植物细胞破碎不完全，造成提取的黄酮得率低；超声时间过长，产生的热效应可能造成黄酮的氧化，从而使黄酮得率降低。因此，选择超声波时间为50 min 比较合适。

2.2.2 超声波温度对黄酮得率的影响

超声波温度对黄酮得率的影响见图3。

图3 超声波温度对黄酮得率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the yield of flavonoids

由图3 可知，在超声温度为20 ℃～60 ℃时，黄酮得率逐渐上升，在60 ℃达到最大值，其值为（26.300±0.024）mg/g，随着超声温度继续升高，黄酮得率下降，超声温度为80 ℃时，黄酮得率下降至（24.160±0.035）mg/g。可能原因是超声波温度过低，分子热运动慢，不利于黄酮的溶出；温度过高，黄酮易分解，造成得率降低。因此，选择超声波温度为60 ℃比较合适。

2.2.3 超声波频率对黄酮得率的影响

超声波频率对黄酮得率的影响见图4。

图4 超声波频率对黄酮得率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic frequency on the yield of flavonoids

由图4 可知，在超声频率为 20 kHz～50 kHz 时，黄酮得率逐渐上升，在50 kHz 时达到最大值，其值为（26.081±0.073）mg/g，随着超声频率继续增加，黄酮得率下降，超声频率为80 kHz 时，黄酮得率下降至（20.412±0.035）mg/g。因此，选择超声波频率为50 kHz比较合适。

2.3 响应面试验结果

2.3.1 分响应面析方案与试验结果

按照表1 设计进行响应面试验，分析方案与试验结果见表2。

表2 响应面分析方案与试验结果Table 2 Response surface analysis scheme and test results

2.3.2 回归方程的建立及显著性分析

根据响应面试验结果，采用ANOVA 对表2 中的数据进行多元二次回归，得到黄酮得率（Y）与超声波时间（A）、超声波温度（B）、超声波频率（C）之间的二次多项回归方程为：

Y=-32.033 25+1.810 62A+0.412 48B+0.038 250C+1.450 00×10-3AB-6.375 00×10-3AC+4.625 00×10-3BC-0.016 105A2-5.622 00×10-3B2-2.800 00×10-4C2。回归模型方差分析见表3。

表3 为回归方程的方差分析表，由方差分析结果可知，该回归方程模型极显著（P＜0.01），失拟项P 值为0.127 4＞0.05，失拟性差异不显著。B、AC、A2、B2对侧柏叶黄酮得率的影响极显著（P＜0.01），A、C、BC 对侧柏叶黄酮得率的影响显著（P＜0.05），AB、C2对侧柏叶黄酮得率的影响不显著（P＞0.05），各因素对黄酮得率的影响依次是B（超声波温度）＞A（超声波时间）＞C（超声波频率）。相关系数R2为0.967，变异系数为1.180%，表明试验数据较可靠，该模型拟合度较高，可以用于超声波法提取侧柏叶中总黄酮的理论预测。

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.3.3 响应面分析

响应值与各试验因素，及各因素交互作用构成的等高线和响应面见图5、图6、图7，考察超声波时间、超声波温度、超声波频率中任意一个因素水平在零时，其他两个因素的交互作用对黄酮得率的影响。图5为超声波频率为50 kHz 时，超声波时间和超声波温度对黄酮得率的影响。

由图5 可以看出，在超声波时间一定时，黄酮得率随超声波温度先增大然后趋于平缓；在超声波温度一定时，黄酮得率随超声波时间先增大后降低。等高线接近圆形，且响应面坡度较小，表明超声波时间和超声波温度的交互作用不显著，这与回归方程方差分析的结果相符。图6 为超声波温度为60 ℃时，超声波时间和超声频率度对黄酮得率的影响。

图5 超声波时间和超声波温度对黄酮得率的等高线和响应面图Fig.5 Contour and response surface of ultrasonic time and temperature to flavonoid yield

图6 超声波时间和超声波频率对黄酮得率的等高线和响应面图Fig.6 Contour and response surface of ultrasonic time and frequency to flavonoid yield

由图6 可以看出，在超声波时间一定时，黄酮得率随超声波频率先增大后趋于平缓；在超声波频率一定时，黄酮得率随超声波时间先增大后降低。等高线密集，且接近椭圆形，响应面坡度较陡峭，说明超声波时间和超声波频率的交互作用极显著。图7 为超声波时间为50 min 时，超声波温度和超声波频率对黄酮得率的影响。

图7 超声波温度和超声波频率对黄酮得率的等高线和响应面图Fig.7 Contour and response surface of ultrasonic temperature and frequency to flavonoid yield

由图7 可以看出，在超声波温度一定时，黄酮得率随超声波频率先增大后降低；在超声波频率一定时，黄酮得率随超声波温度的增大而降低。等高线密集且响应面坡度陡峭，说明超声波温度和超声波频率的交互作用显著。

2.3.4 最佳工艺条件的确定及验证试验

根据所得到的回归模型，预测得到超声波法辅助提取侧柏叶中黄酮的最佳工艺条件为：超声波时间50.98 min、超声波温度59.38 ℃、超声波频率40 kHz，此时侧柏叶总黄酮理论得率可达26.430 mg/g。结合实际情况将最佳工艺条件修改为：超声波时间51 min、超声波60 ℃、超声波频率40 kHz，并在此条件下进行3次验证试验，结果侧柏叶总黄酮平均得率（26.350±0.065）mg/g，实际值与理论值26.430 mg/g 的误差仅为0.08%，证明了该试验模型合理，优化的提取工艺切实可行，适用于侧柏叶总黄酮的提取。

3 结论

本试验采用超声波法辅助提取侧柏叶总黄酮，通过单因素试验，考察超声波时间、超声波温度、超声波频率对黄酮得率的影响，并通过响应面法优化提取工艺。通过回归模型预测得到超声波法辅助提取侧柏叶中黄酮的最佳工艺条件为：超声波时间51 min、超声波温度60 ℃、超声波频率40 kHz，此时黄酮得率为（26.350±0.065）mg/g，优化得到的工艺合理可行，为侧柏叶黄酮的充分提取以及应用提供了理论依据，同时也为超声波法辅助提取其他中草药活性物质提供了新思路。