PD-1/PD-L1在肝细胞癌预后判断作用中的研究进展

李小松，姜涛

吉林大学中日联谊医院，长春130033

肝细胞癌(HCC)是最常见的癌症之一，是全球第二大癌症相关死亡原因[1]。随着影像技术的进步，HCC的诊断率大幅上升。近三分之一的HCC患者接受根治性手术切除或肝移植，对于术后复发和中晚期丧失手术机会的患者则可选择如射频消融、经动脉化疗栓塞术、索拉非尼等常规治疗，但总的来说，HCC患者生存预后并不乐观。而目前针对免疫检查点的肿瘤免疫治疗成为了HCC治疗的新希望。在众多免疫检查点信号因子中，程序性死亡蛋白-1/程序性死亡蛋白-1配体(PD-1/PD-L1)在肿瘤免疫过程中发挥重要作用，可诱导肿瘤免疫抑制微环境，促进肿瘤增殖和转移。许多研究表明肿瘤患者中PD-L1高表达与生存率高度相关[2,3]，PD-1/PD-L1有希望作为临床预后标志物。现就PD-1/PD-L1在HCC中的免疫作用机制及其对HCC预后判断作用研究进展予以综述。

1 PD-1/PD-L1在HCC中的免疫作用机制

肿瘤诱导的免疫抑制是肿瘤增殖和逃避免疫系统的主要机制之一。肿瘤细胞利用多种免疫抑制途径来抵抗肿瘤免疫，其中一种方式是通过PD-1/PD-L1轴，PD-1/PD-L1是重要的“免疫检查点”[4]。慢性乙型肝炎病毒感染是肝硬化和HCC的主要病因之一[1]。乙肝病毒可引起慢性病毒性炎症、纤维化和肝硬化，并最终导致HCC的发生。在慢性乙型肝炎病毒感染期间，持续的固有和适应性免疫反应有助于免疫耐受和肿瘤的增殖。PD-1/PD-L1通路在慢性感染、肿瘤免疫逃逸和肿瘤微环境的形成中发挥着关键作用[5]。PD-1是CD28家族成员之一，有PD-L1、PD-L2(也称为B7-H1、B7-DC)两种配体，具有共刺激分子的特性。虽然与PD-1/PD-L1相比，PD-1/PD-L2高出2～6倍的亲和力，但PD-L1仍被认为是PD-1的主要配体[6]。PD-1是一种免疫共抑制受体，表达于T细胞、B细胞、自然杀伤细胞和髓系细胞上。在T细胞上，PD-1通过与其配体PD-L1和PD-L2的相互作用抑制T细胞的活化[7]。PD-L1在树突状细胞上表达，广泛存在于血管、心肌、肺、胎盘等组织中。而PD-L2的表达仅限于树突状细胞、感染或免疫反应(如炎症)的晚期激活阶段，在T细胞上选择性表达。PD-1在周围组织的效应T细胞中表达尤为强烈。与PD-1不同的是，PD-L1在免疫反应发生过程中在正常的外周组织和大多数免疫细胞中都有广泛性表达。相反，PD-L2的表达是选择性的，局限于抗原提呈细胞，参与了淋巴结T细胞活化。因此，PD-1和PD-L1抗体在免疫治疗中同样有效，而PD-L2发挥作用有限。在T细胞介导免疫过程中，T细胞识别肿瘤细胞上MHC分子所表达的肿瘤抗原后被激活，释放穿孔蛋白和颗粒酶，进而攻击肿瘤细胞,同时激活T细胞释放γ-干扰素和其他细胞因子。在这些细胞因子的作用下，癌细胞上调PD-L1的表达，使其与T细胞上的PD-1结合，从而减弱T细胞的攻击。PD-L1与PD-1结合后，在肿瘤细胞和抗原提呈细胞上异常高表达，激活PD-1 /PD-L1通路减弱T细胞抗肿瘤活性，诱导T细胞凋亡；抑制颗粒酶和穿孔素生产；减少γ-干扰素、肿瘤坏死因子等分泌；致细胞周期停滞不前；最终导致免疫逃逸或免疫耐受。癌细胞是如何诱导PD-L1在抗原细胞上表达，其机制尚不明确。与传统的化疗和分子靶向治疗不同，免疫治疗利用了人体免疫系统的天然抗肿瘤反应，旨在维持和加强其作用[8～10]。PD-L1抗体与PD-1抗体作用类似。免疫调节通路中大量共刺激分子的产生多呈现出两种形式，即膜结合形式和可溶性形式。分子的可溶性形式通常由共刺激蛋白的膜结合形式的蛋白水解而产生，如可溶性肿瘤坏死因子[11]和sB7-H3[12]，或通过翻译选择性剪接mRNA产生，如sB7-2和sCTLA-4。同样，PD-1/PD-L1的可溶性形式也得到了证实。PD-1/PD-L1通路分子包括膜结合形式PD-1/PD-L1(mPD-1/mPD-L1)和可溶性PD-1/PD-L1(sPD-1/sPD-L1)，在肿瘤的T细胞免疫反应中都发挥重要免疫抑制作用[13～15]。

2 PD-1/PD-L1在HCC患者不同治疗预后中的作用

2.1 手术切除治疗 随着人们对PD-1/PD-L1通路在肿瘤免疫的重要性的逐步认识，越来越多研究探讨了肿瘤细胞上PD-1、PD-L1表达与患者预后之间的关系。2009年，Gao等[16]研究选择接受手术切除治疗的HCC患者，通过免疫组化对肿瘤组织标本中PD-1、PD-L1表达进行评估，进而探讨PD-1、PD-L1表达与患者临床病理特征及预后之间的关系。此研究包括240例接受手术切除的HCC患者，发现PD-L1表达阳性的患者无病生存期(DFS)和总生存期(OS)明显低于PD-L1表达阴性的患者。PD-L1阳性患者的DFS和OS中位数分别为14.9、29.6个月，而PD-L1阴性患者的DFS和OS中位数分别为59.4、14.9个月。与PD-L1阴性患者相比，PD-L1阳性患者复发的可能性几乎是PD-L1阴性患者的两倍。在晚期肝内复发患者中，PD-L1是高度相关免疫标志物，显著高于非复发患者(P=0.007)。PD-L1表达与患者DFS、OS有高度相关性，PD-L1高表达的患者会出现更差的临床预后结果。Wu等[17]的研究同样证实了PD-L1高表达与较差的生存率高度有关。有的研究还发现，PD-L1的表达与CD8+T细胞浸润正相关[18～20]，这也验证了PD-1/PD-L1轴在T细胞活化过程中的作用。多个研究发现，PD-L1表达与病毒载量正相关[21,22]，PD-1可以使慢性乙型肝炎病毒感染患者发生基因变异最终导致肝硬化[23]。Pei等[24]的研究也进一步证实了PD-L1的表达与肝硬化显著相关(P=0.016)。

但在之后的多个研究[19～22,24～27]发现，PD-L1与生存期无明显相关，不能作为临床预后指标。甚至有些研究表明PD-L1高表达与较好的生存期相关[28～30]，与之前研究结果正好相反。这些研究结果之间的不一致可能归于多个原因。我们深入分析发现，多项研究在检测抗体和用于检测PD-L1表达的染色模式有很大区别。例如,Gao等的研究利用小鼠抗PD-L1抗体用于免疫组化分析，然而他们并没有区分HCC肿瘤细胞在细胞膜和细胞质中PD-L1染色情况,只是根据面积和颜色密度粗略地定义“高”和“低”的PD-L1表达。而且目前采用免疫组化染色强度或密度评分的方法来定义肿瘤细胞PD-L1表达阳性的方法已经过时，现为了简化PD-L1表达阳性的定义标准，专家提出使用阳性细胞表达百分比≥1%[31]作为临界值，之后Nivolumab的临床试验便采用了此方法[32]。另外，检测抗体不一致同样会造成研究结果的差异。最近几项采用阳性细胞表达百分比定义PD-L1表达阳性的研究显示，PD-L1表达与OS高度相关[33,34]。最新的一项meta分析[35]也指出，PD-L1高表达的患者有较差生存率，PD-L1与DFS(HR=2.07,95%CI:1.20～3.58,P=0.009)及OS(HR=1.57,95%CI:1.09～2.27,P<0.00001)显著相关，此meta分析还指出PD-L1的表达与肝硬化显著相关。综上所述，PD-1/PD-L1作为预后生物标志物仍有待进一步验证。

2.2 其他常规治疗 众所周知，只有少部分的HCC患者可以手术治疗，而绝大多数非转移的HCC患者采用的治疗方法如射频消融、经肝动脉化疗栓塞等治疗[36]。由于HCC患者的肝活检并不是常规项目，在这样的情况下，PD-1或PD-L1表达通过免疫组化染色测定是存在困难的。我们还发现，肿瘤微环境的PD-L1阳性癌细胞或PD-L1阳性的非肿瘤细胞在HCC中可能并不均匀分布。肿瘤组织的一部分可能是PD-L1阳性，而另一部分可能是阴性，而目前活检标本的范围，无法准确描述PD-L1表达的分布情况。这些限制都导致了PD-1/PD-L1相关研究对于非手术患者的临床价值，而此时血清中sPD-1/sPD-L1显示出特有的价值。Finkelmeier等[37]通过研究215例经过射频消融或动脉化疗栓塞治疗后患者的血清，发现血清中sPD-L1水平高的患者死亡风险增加(HR=3.34,95%CI：1.61～6.93,P<0.001)，而sPD-L1水平低的患者预后较好。此外还发现sPD-L1与巨噬细胞活化(sCD163)和炎症(C反应蛋白)的标志物表达呈正相关。之后的数项研究证明，血清中sPD-L1水平与OS高度相关，低水平的患者预后更好[38～40]。Kim等[38]还发现，放疗后1个月sPD-L1水平升高与早期肺转移显著相关(P=0.015)。另一研究观察到多个炎性细胞因子(IL-10、IL-17、TNF-α)和sPD-1或sPD-L1呈正相关[40]。Han等[39]观察到，有乙型肝炎背景的HCC患者血清中sPD-L1水平明显高于健康对照组；同时发现肿瘤组织PD-L1高表达患者的血清sPD-L1水平也随之升高，但由于sPD-L1来源的多样性，血清sPD-L1水平与肿瘤组织PD-L1表达仅呈中度正相关。目前，sPD-L1的检测多采用酶联免疫吸附实验(ELISA),但其临界值尚无统一结论，需要更多临床研究进行验证。

2.3 免疫治疗 最近研究表明，各种恶性肿瘤患者在接受免疫治疗后可取得一定效果。然而，部分癌症患者存在低反应和免疫相关的不良事件。这就需要开发一类生物标志物来预测免疫检查点抑制剂的相关事件发生情况。虽然目前研究有限，但已经发表了一些初步研究。如最近报道的一项回顾性研究包括290例HCC患者，145例接受手术治疗，其余145例接受手术联合细胞因子诱导的杀伤细胞灌注(CIK)治疗。结果表明，在接受手术切除联合CIK灌注治疗的患者中，PD-1高表达与OS和DFS高度相关[27]，而单纯手术患者PD-1/PD-L1表达与生存预后无明显相关性。另一项对448例HCC患者[单纯肝切除术217例(手术组)、肝切除术同时术后CIK细胞输注231例(联合治疗组)]的对照研究表明，PD-L1阳性患者在联合治疗组的OS更好，而在手术组没有显著差异[21]。上述两项研究都显示，在单纯肝切除术患者中PD-1/PD-L1表达与DFS/OS之间没有关联。由此可以看出，PD-1/PD-L1的检测在HCC的免疫治疗中有重要临床意义。然而，最近的CheckMate 040试验显示，以1%为临界值，PD-L1表达水平与接受Nivolumab治疗的晚期HCC患者的应答率之间没有显著关联。174例患者中只有20%的患者PD-L1阳性，PD-L1表达阳性组与阴性组相比，患者预后无显著差异。导致此结果的原因可能是，研究人员免疫组化染色只量化了癌细胞上的PD-L1表达，忽略了肿瘤微环境中免疫细胞也可表达PD-L1的事实。因此在未来的临床试验中，需要更加细致评估各种免疫相关细胞中PD-L1表达与患者预后的关系。

综上所述，虽然PD-1/PD-L1表达与患者预后有一定关系，但是作为预后标志物仍受到许多因素的限制，如通过免疫组化方式检测PD-1/PD-L1表达会受到各方面的干扰(检测抗体的选择、不同临界值、组织的制备、肿瘤微环境中免疫相关细胞的染色问题等)；且血清中sPD1/sPD-L1面临着来源复杂、临界值尚不明确等问题。以上这些问题都需要进一步的临床研究来验证。随着PD-1/PD-L1研究不断的深入，我们相信PD-1和PD-L1将会在HCC的预后判断方面发挥更大的作用。