负载胰岛素PLGA微球对种植体周围成骨影响的动物研究*

魏雪竺 刘长营 李贝贝 李 钧 马 攀

口腔种植技术作为一种新兴的技术发展迅速，种植适应症范围也在不断扩大，包括糖尿病在内的许多全身疾病在控制稳定的前提下都可以作为种植的适应症[1]。而高血糖患者的种植仍然是相对高风险的，我国作为2型糖尿病患者的患病大国，血糖控制目前不容乐观[2]，仍有许多患者因为血糖无法控制到理想范围无法进行口腔种植[3]。因此需要进一步研究适合高血糖的2型糖尿病患者的种植技术方法，相关研究主要仍在动物研究的阶段[4]。种植体相关的动物研究主要采用的成品种植体直径较大，不适用于大鼠等小型实验动物。且成品种植体表面大多采用涂层处理，表面不利于加载药物，往往需要更多的动物样本[5]。本研究拟设计并制作一种新型的应用于大鼠等小型动物的种植体，应用该种植体并负载甘精胰岛素PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)微球，观察对GK大鼠(2型糖尿病大鼠)种植体周围成骨的影响。

图1 种植体设计图及封闭螺丝示意图

1.材料与方法

1.1 材料 动物用种植体10枚；雄性GK大鼠10只；甘精胰岛素PLGA微球，空白微球；矫正共振频率分析测量仪(Osstell ISQ，瑞典)等。

PLGA微球制作：采用W/O/W法制作甘精胰岛素及空白PLGA微球。

1.2 自主设计的新型种植体模型 本实验所采用的种植体材质为纯钛种植体，种植体外形图如图1所示。种植体长度6mm，直径2.8mm，表面为无螺纹的光滑表面。种植体内径为1.8mm，内部有螺纹，种植体内部螺纹与Bego种植体内部螺纹一致。种植体与封闭螺丝接口处内侧设计为45°的斜面，以便于种植体和封闭螺丝更好的吻合。种植体内径与Osstell ISQ测量仪套装中Bego种植体的SmartPeg感应器(共振频率测量杆)吻合，以便实验过程中测ISQ值。种植体表面采用微弧氧化处理。种植体由北京莱顿生物有限公司制作。

1.3 实验动物及分组 将10只12周龄的GK大鼠饲养一周。测定血糖值，血糖＞16.7mmol/L表示建模成功，10只大鼠均符合建模要求，将大鼠采用抽签法随机分成2组，每组5只。2组分别为甘精胰岛素组和空白对照组。

1.4 实验方法 实验组及对照组术前半小时腹腔注射30mg/kg青霉素预防感染。水合氯醛腹腔内注射麻醉大鼠，StraumannR○手术工具盒中先锋钻、直径2.2mm、2.8mm环形齿科钻预备种植体窝，并于右侧膝关节内侧植入种植体。甘精胰岛素组大鼠在种植体植入前，给予局部200μg PLGA微球负载与种植体表面。使用精确度为0.0001g的天平，称取2mg PLGA微球，在96孔板内溶于0.2ml生理盐水中，用加样枪轻轻吹匀后吸取20μl，在种植体植入前放于种植窝内，之后植入种植体。对照组则将0.02%三羟甲基氨基甲烷的空白PLGA微球加入制备好的种植窝内。测定初始ISQ值后分层缝合。并在种植手术植入后第3、4、5、6周，局麻下测量ISQ值，测量3次取平均值。在第6周测量完成大鼠ISQ值后，处死大鼠，拍摄CT(结果如图3所示)。截取右侧胫骨，用于种植体骨磨片。种植体骨磨片采用亚甲基蓝-品红染色，使用Image Pro Plus软件分析测量种植体-骨界面长度及种植体-骨整合长度，并计算种植体-骨整合率。对两组GK大鼠每周进行血糖测量。

1.5 统计学分析 结果使用SPSS22.0统计分析软件。对同一周甘精胰岛素组和空白对照组的数据进行独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

甘精胰岛素标准品制得的PLGA微球载药量为24.87%±0.57%，包封率为62.19±1.41%。扫描电子显微镜下可见微球形态如图2所示基本为球型，甘精胰岛素组PLGA微球平均直径4.34±1.65μm，对照组PLGA微球平均直径4.18±1.29μm。使用吸光度法测得甘精胰岛素PLGA微球12h释放率35.36%，2d释放率67.25%，8d释放率88.55%，14d释放率94.49%。

图2 甘精胰岛素(左图)及对照组(右图)PLGA微球

甘精胰岛素组及对照组大鼠实验前后的血糖值如图3所示。甘精胰岛素组和对照组每周测量血糖值均大于18mmol/L，且每周两组间血糖值差异不具有统计学意义(P＞2.61)。

图3 大鼠血糖值

甘精胰岛素和对照组ISQ值如表1所示。甘精胰岛素组第4、5、6周ISQ值及第6周种植体骨结合率显著高于对照组。两组ISQ值从第3周起呈现明显的增长趋势，且甘精胰岛素组ISQ值高于对照组。在第1、3周两组间ISQ值没有统计学差异，而在第4、5、6周甘精胰岛素组ISQ值显著高于对照组。第6周时CT如图4所示可见2组种植体周围可见骨结合，磨片染色如图5所示，可见新生成的骨小梁，计算甘精胰岛素组种植体骨结合率(种植体骨结合率为59.73±0.92%，对照组种植体骨结合率为44.6±0.97%，甘精胰岛素组种植体骨结合率显著高于对照组(如图6所示)。

表1 甘精胰岛素和对照组ISQ值(无单位)

图4 第6周GK大鼠种植体CT图像(左图为甘精胰岛素组，右图为对照组)

图5 种植体磨片(左图为甘精胰岛素组，右图为对照组，下图为完整视野下种植体磨片)

图6 第6周种植体骨结合率

3.讨论

设计的种植体形态能够满足12周龄GK大鼠胫骨植入时的需要，种植体内径的设计也能够满足实验中测定ISQ值的需要，对纯钛种植体表面进行微弧氧化能够使种植体获得良好的生物相容性。通过测定实验动物的种植体稳定性增长水平，避免过多的实验动物分组，减少实验动物数量。微弧氧化处理的种植体表面负载微球，氧化层表面为加载药物提供了空隙，增加了种植体的表面积，有利于成骨[6]。光滑表面的种植体较螺纹表面的种植体更有利于观察和计算种植体骨结合率，并且有利于种植体表面进一步实验研究时负载药物的均匀分布。甘精胰岛素PLGA微球通过类胰岛素样作用，促进大鼠高糖环境下种植体周围的骨结合[7]。与传统加药方式相比，甘精胰岛素PLGA微球能够在种植体表面缓慢、持续的释放，药物的作用时间相对较长，不需要多次给药[8]。且局部的精准给药排除了甘精胰岛素降糖作用导致的骨结合率增高[9]。另一方面甘精胰岛素PLGA微球制作成本较高，且并不能长时间存放，在体外的储存环境下其微球依然会缓慢破裂[10]。

种植体植入后ISQ值的测量数据为第1、3、4、5、6周，并没有测量第2周的ISQ值。因为在之前进行的预实验中，在第2周旋出封闭螺丝时种植体也随封闭螺丝一同旋出。这可能是因为种植体植入初期破骨细胞相对活跃[11]，并没有形成相对良好的骨结合，且本实验设计的光滑表面并没有机械固位力。从第1周到第3周，种植体ISQ值增长相对缓慢，且甘精胰岛素组与对照组间并没有统计学差异，这可能是因为甘精胰岛素的类胰岛素样作用对种植体在植入初期种植体-骨界面破骨细胞主导的破骨活动并不显著[12]。甘精胰岛素组PLGA微球释放的甘精胰岛素产生的类胰岛素样作用主要促进成骨细胞改建[13]。从第3周起种植体表面成骨活动活跃，ISQ值稳步增加。

本实验设计的光滑表面短种植体能够成功应用于GK大鼠，获得良好的生物相容性，在高血糖环境下获得一定的骨结合。甘精胰岛素组GK大鼠种植体稳定性增长水平和种植体骨结合率明显高于对照组，进一步证实了PLGA微球负载的甘精胰岛素对2型糖尿病大鼠种植体周围成骨具有促进作用[14]。