黔产忍冬叶中木犀草苷含量测定*

马子力，黄兴龙，冯剑英，姚元贵，刘春艳，马四补，张 卫，胡欣悦，张丽艳▲

(1贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025； 2贵州省赤水市人民医院，贵州 赤水 564700)

忍冬为忍冬科忍冬属半常绿缠绕灌木，忍冬药用历史悠久，早在汉末《名医别录》中就有关于忍冬为“上品”的记载[1]。2015版《中国药典》已将“金银花”“忍冬藤”列为药用植物[2]，同时药典中将金银花中绿原酸和木犀草苷的含量作为其主要质控指标[3]。其花及花蕾有清热解毒、凉散风热的功效[4]。忍冬花又称金银花，目前金银花作为抗病毒常用药材[5]，已广泛投入临床应用。金银花市场需求量大，导致药材价格居高不下，亟需新的药材替代品。笔者通过查阅典籍发现，晋代《肘后备急方》便有“忍冬茎叶挫数壶煮”的记载[6]，表明“叶”同样为该药材的药用部位。临床研究表明，使用鲜忍冬叶泡茶，急性肠炎患者可以在三天内被治愈[7]。现代药理学研究表明，忍冬叶中同样含有绿原酸及木犀草苷[8]，木犀草苷除具有抗菌、抗病毒、抗氧化等药理作用之外，对人体的呼吸系统、心血管系统以及中枢神经系统还具有一定程度的保护作用[9]。本研究旨在通过高效液相色谱法检测黔产忍冬叶中木犀草苷含量，为黔产忍冬叶载入地方标准提供实验基础和科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

安捷伦1260高效液相色谱仪(安捷伦公司)；METTLER TOLEDO XSE105DU型十万分之一电子分析天平(梅特勒公司)；LE204E型电子分析天平(METTOER TOLEDO公司)；KQ-500DE型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

甲醇(色谱纯，TEDIA High Purity Solvents)；乙腈(色谱纯，TEDIA High Purity Solvents)；甲醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；木犀草苷对照品(中国食品药品检定研究院，11720-201609，纯度≥98%)，纯净水(娃哈哈集团有限公司)；磷酸(分析纯，成都金山化学有限公司)。

样品于2017年采自贵州省各区县，阴干。药材经贵州中医药大学植物栽培教研室魏升华教授鉴定为忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThund.的干燥叶。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Phenyl柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙睛：0.5%甲酸梯度洗脱；检测波长：350 nm；柱温：35 ℃；进样量10 μL。

2.2 对照品溶液制备

精密称取木犀草苷对照品1.68 mg置于10 mL量瓶，用80%甲醇溶解并定容、摇匀，即得0.1646 mg/mL对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

取药材粉末约1 g，精密称定，置锥形瓶中，加入80%甲醇50 mL，称定重量，超声60 min称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，精密量取20 mL样品溶液，置蒸发皿中挥干，再用80%甲醇定容至5 mL容量瓶中，并经微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得。

2.4 线性关系考察

将上述对照品溶液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，吸取对照品溶液各1 μL、2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL按上述色谱条件进样测定。峰面积为纵坐标，进样量为横坐标进行线性回归，得回归方程y=2023.8x- 39.58，R2=0.9997。表明在进样量0.1646～1.6460 μg范围内呈良好的线性关系，结果见表1及图1。

表1 线性关系结果(n=6)Tab.1 Results of the linear relationship (n=6)

图1 木犀草苷标准曲线图Fig.1 Standard curve of luteoloside

2.5 精密度考察

按上述色谱条件将对照品溶液连续进样6次，测定峰面积为3308.4、3328.1、3366.8、3206.6、3131.1、3232.7，计算其RSD为2.69%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性实验

精密称取样品1份(产地：贵州 龙里)供试品溶液，按上述色谱条件每隔5 h进样1次，共进6次，测定峰面积为591.0、604.4、602.8、567.2、572.3、571.3，计算其RSD为2.86%，表明样品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性实验

精密称取6份(产地：贵州 龙里)供试品溶液，各约1 g，按上述供试品溶液的制备方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件测定。计算其百分含量的RSD结果为1.52%，表明方法重复性良好。

2.8 加样回收率实验

取6份已知含量的药材粉末(产地：贵州 龙里)约0.5 g，精密称定后，分别加入3.8612 μg/mL浓度的对照品溶液各50 mL，按上述条件进行供试品溶液的制备；按上述色谱条件进行含量测定，按公式回收率=(测得量-样品中的含量)/(加入对照品的量)×100%计算，结果表明平均回收率为98.36%，RSD=1.39%，见表2所示。

表2 加样回收试验结果(n=6)Tab.2 Spiked recovery rate results(n=6)

2.9 样品测定

各样品粉末按“2.3供试品溶液制备”项下制备得到供试品溶液，精密吸取各供试品溶液 10 μL，注入液相色谱仪，平行测定2次，计算木犀草苷含量，得到14批样品中木犀草苷含量为0.0261%～0.050%，平均含量为0.035%。其中2号样品含量最低，为0.0261%；10号样品木犀草苷含量最高，为0.050%，结果见表3。

表3 样品含量测定结果(n=2)Tab.3 Results of the content determination (n=2)

3 讨论

本研究采用DAD检测器在紫外区190～400 nm对木犀草苷进行全波长扫描，得到木犀草苷在350 nm处有最大吸收，因此选取350 nm为检测波长。本实验主要考察了乙腈-0.5%磷酸(A)、乙腈-0.5%醋酸(B)、乙腈-0.5%甲酸(C)3种流动相体系，发现以乙腈-0.5%甲酸为流动相时，木犀草苷分离效果佳且峰形好，所以本实验选择乙腈-0.5%甲酸作为流动相，同时对3个不同厂家的色谱柱Agilent ZORBAX SB-Aq (4.6 mm×250 mm，5 μm)、inerTsustain AQ-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Welch Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)进行考察，结果以Agilent ZORBAX SB-Phenyl色谱柱分离度高，峰形较其他色谱柱好，故选用该色谱柱。此外本实验考察了不同浓度甲醇、不同提取时间对忍冬叶中木犀草苷含量的影响，结果在甲醇浓度为80%、超声提取为60 min时木犀草苷含量最高。在上述条件下，本研究对该方法流速、柱温、甲酸浓度进行了一系列的耐用性考察，最终确定木犀草苷在1.0 mL/min、35 ℃、0.5%甲酸条件下色谱图基线平稳、木犀草苷分离度较好、峰形较好、理论塔板数高。

该研究采用HPLC-DAD法对忍冬叶中木犀草苷含量进行测定，并经方法学验证，结果该方法精密性、稳定性、重复性均良好，表明该方法稳定可靠。通过对黔产14批忍冬叶样品中木犀草苷含量进行测定，其结果均值为0.035%，依据试验结果及药典相关规定按照平均值下浮20%，初步确定忍冬叶药材干燥品含木犀草苷不得少于0.028%。该方法将为黔产忍冬叶载入地方标准提供实验基础和科学依据。