盆炎净胶囊的HPLC指纹图谱及聚类、主成分分析

周 和 谭翔匀 冯 华 王奥

1.遵义市食品药品检验所，贵州 遵义 563000： 2.遵义市产品质量检验检测院，贵州 遵义 563000

盆炎净胶囊处方由忍冬藤、川芎、狗脊、鸡血藤、赤芍、车前草等八味中药材组成[1]，具有和血通络、清热利湿、调经止带的功效，主要用于白带过多、湿热下注等症状[2]。盆炎净胶囊作为中药复方制剂，具有多药味、多成分、多靶点协调作用的特点，常规检测只能检测其单个或几个成分，不能全面、有效、准确地说明中药复方制剂的整体质量和确切疗效[3-4]。因而，建立更科学有效、更系统完整的检测方法，对控制盆炎净胶囊质量具有重要意义。中药指纹图谱具有整体性、相似性的特点，是一种能突出中药及其制剂完整面貌的有效方法。结合相似度评价、系统聚类分析与主成分分析，有助于中药及其制剂中多种化学成分的综合评价，从而控制其整体质量。近年来，该技术已广泛用于中药及其制剂的质量评价[5-12]。因此，本研究采用HPLC法中的梯度洗脱模式，建立了10批盆炎净胶囊高效液相指纹图谱。通过系统聚类分析与主成分分析，挖掘指纹图谱中蕴含的其他信息，对盆炎净胶囊进行综合评价，以期为盆炎净胶囊的质量控制提供一定的参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器与试剂 Agilent高效液相系统(配有四元梯度泵，光电二极管阵列检测器，柱温箱，Agilent 1260工作站和处理软件)，Waters XSelect HSS T3 (4.6 mm × 250 mm，5 μm)柱；XPE56型十万分之一电子天平(梅特勒)，KQ-500DV型数控超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试剂与药品 马钱苷、芍药苷、原儿茶酸对照品(购于中国食品药品检定研究院，批号分别：111640-201808、110736-20184、211809-201205)，乙睛、磷酸为色谱纯，水为娃娃哈纯净水，其余试剂为分析纯，10批次盆炎净胶囊(批号分别为：190601、190602、190603、190604、190605、190701、190702、190703、190704、190705)遵义华卫制药提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱waters XSelect HSS T3 (4.6 mm ×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈(A)-0.5%醋酸溶液(B)，梯度洗脱(洗脱程序见表1)；检测波长为235 nm；流速：1.0 mL/min，柱温25℃，进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 称取原儿茶酸、马钱苷、芍药苷对照品适量，分别用甲醇溶解制成含原儿茶酸0.10 mg/mL、马钱苷0.31 mg/mL、芍药苷0.52 mg/mL的单一对照品溶液，摇匀，用0.45μm 的微孔滤膜滤过，即得。

2.2.2 供试品溶液 取盆炎净胶囊内容物适量，研细，取约2.0 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称重，超声50 min，放至室温，用甲醇补足减失的重量，摇匀，取续滤液，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取上述供试品溶液(批号：190701)，按“2.1”项下色谱条件连续进样检测6次，记录色谱图。以芍药苷峰(10号峰)为参照峰，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.63%(n=6)，相对峰面积的RSD均小于0.95%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.2.2 重复性试验 取盆炎净胶囊(批号：190701)内容物适量，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，共6份，按上述色谱条件进样测定，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，18个共有峰相对保留时间RSD均小于0.93%(n=6)，相对峰面积的RSD均小于1.56%(n=6)，表明重复性良好。

2.2.3 稳定性试验 取(批号：190701)同一供试品溶液，分别在0,2,4,6,8,10,12,24 h进样检测，记录色谱图。以芍药苷峰(10号峰)为参照峰，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于1.87%，表明在室温条件下，供试品溶液24 h内基本稳定。

2.4 指纹图谱

2.4.1 指纹图谱的生成 取10批盆炎净胶囊内容物适量，按“2.2.2”项下方法，依次制备10批供试品溶液，再按“2.1”色谱条件测定，记录色谱图。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”，对10批样品的HPLC图谱进行分析，得HPLC指纹图。如图1、图2所示。

2.4.2 相似度分析 采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(版本 2004 A)”，以样品的HPLC对照指纹图谱为参照，进行整体相似度评价，详见表2。结果显示，10批样品相似度均大于0.95以上，表明各样品间差异较小，质量稳定性良好。

表2 相似度评价结果

2.4.3 指认共有峰 分别取“2.2.1”项下原儿茶酸(狗脊药材所含成分)、马钱苷(忍冬藤药材所含成分)、芍药苷(赤芍药材所含成分)单一的对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，并与样品的HPLC对照图谱进行对比指认。结果，共有峰中3、7、10号色谱峰分别指认为原儿茶酸、马钱苷、芍药苷。如图3所示。

2.4.4 共有峰的相关分析 10批样品共有18个共有峰，其峰面积总和占色谱峰总面积的92.96%。由图3可知，10号峰芍药苷峰面积较大，位置适中，与相邻色谱峰分离度>2.26，在色谱中稳定，故以其保留时间和峰面积为参照，计算其它共有峰的相对保留时间、相对峰面积，结果见表3、表4。

表3 共有峰相对保留时间

表4 共有峰相对峰面积

续表4 表4 共有峰相对峰面积

2.5 聚类分析 采用SPSS 19.0统计软件分析，变量为10批盆炎净胶囊HPLC指纹图谱中标定的21个共有峰的绝对峰面积，先标准化原始数据，再依据欧氏距离依次进行系统聚类分析，结果详见图4。由图4可知，10批盆炎净胶囊可分为2类，样品S1、S2、S8可聚为一类，S3、S4、S5、S6、S7、S9、S10可聚为一类。

2.6 主成分分析

2.6.1 主成分因子特征值、方差贡献率分析 以特征值>1为主成分因子的筛选标准，采用SPSS 19.0 软件进行主成分因子分析，并计算其特征值和方差贡献率。由表5可知，共有4个主成分因子的特征值符合要求，分别为：8.857、3.792、2.252、2.144。4个主成分因子的累积方差贡献率为94.696%，说明前4个主成分可代表样品大部分信息，适用于主成分分析。依据主因子载荷绝对值越大，对主成分贡献越大，由表6可知，主成分因子1反映了峰1、2、4、5、7、8、9、10、14、15、16的信息，主成分因子2反映了峰3、6、13、17、18的信息，峰11、18在主成分因子3上有较高的载荷，峰12在主成分因子4上有较高的载荷。

表5 特征值和方差贡献率

表6 旋转后的主因子载荷矩阵表

2.6.2 综合质量评分 计算4个主成分因子的得分和综合得分(综合得分=主成分因子得分×)，对10批盆炎净胶囊样品质量进行综合评价并排序，结果见表7。由表7可知，主成分因子综合得分最高的为S5号样品(批号：190605)，成分7、9、10、14在该批样品中含量相对较高，整体质量相对较好。

表7 主成分因子得分

3 讨论

本研究成功建立了10批盆炎净胶囊的指纹图谱，确认18个共有峰，并指认出了3个已知成分，分别为原儿茶酸(3号)、马钱苷(7号)、芍药苷(14号)。由图谱可以看出芍药苷峰面积较大，响应高，位置适中，故选择芍药苷为参照峰。经多次摸索，笔者对提取溶剂(乙醇、甲醇、水)，提取方法(超声、加热回流)，提取时间(40 min、50 min、60 min)对比考察发现，以甲醇为提取溶剂，超声50 min的提取效果最简便高效，样品浓度高，液相色谱出峰多。此外，在相同梯度洗脱模式下，采集55 min内获得的指纹图谱，对比甲醇-水、乙睛-水、甲醇-醋酸溶液、乙睛-醋酸溶液4个系统的流动相。结果以乙睛-0.5%醋酸溶液梯度洗脱效果最好，各色谱峰基本达到基线分离、保留时间适中、分离度符合要求，图谱指纹性强，有利于分析。

盆炎净胶囊中含有多味中药材，测定1个或几个指标成分往往具有局限性，不能充分反映其整体质量，因此建立系统的、全面的特征性指纹图谱，结合聚类分析和主成分分析是评价和控制其质量的有效方法。本研究所建立HPLC指纹图谱方法简便、快速、重现性良好，可为盆炎净胶囊的整体质量控制提供一定的参考。