β-胡萝卜素降解菌HC-3发酵条件优化及其对再造烟叶浓缩液增香效果研究

魏涛 陈顺心 黄申 钱玉梅 赵彩梦 毛多斌

关键词：β-胡萝卜素;发酵条件;香味成分;再造烟叶浓缩液

摘要：运用单因素试验和正交试验，对β-胡萝卜素降解菌株HC-3的发酵条件进行优化，并将最佳发酵条件下得到的菌株HC-3发酵液应用于再造烟叶浓缩液中以研究其增香效果.结果表明：菌株HC-3发酵降解β-胡萝卜素的最佳条件为NaNO3质量浓度3 g/L，蔗糖质量浓度30 g/L，酵母粉质量浓度 3 g/L，初始pH值7.0，在该发酵条件下β-胡萝卜素降解率可达93.35%.经菌株HC-3处理后，再造烟叶浓缩液中的二氢猕猴桃内酯、4，7，9-巨豆三烯-3-酮、4-羟基-β-二氢大马酮、9-羟基-4，7-巨豆三烯酮、柠檬酸三乙酯、4-（3-羟基丁基）-3，5，5-三甲基-2-环己烯-1-酮、肉豆蔻酸和新植二烯这8种香味成分含量明显提高;与未经处理的再造烟叶浓缩液相比，利用菌株HC-3处理后的再造烟叶浓缩液制得的片基香气质较好、香气量较足、香气浓度较高、杂气量较低.

Abstract：The fermentation conditions of β-carotene degrading strain HC-3 were optimized by single factor experiment and orthogonal experiment，and the fermentation liquid of strain HC-3 obtained under the optimal fermentation conditions was applied to the reconstituted tobacco concentrate to study its aroma enhancing effect.The results showed that the best fermentation conditions for β-carotene degradation were 3 g/L of NaNO3，30 g/L of sucrose，3 g/L of yeast powder and 7.0 of initial pH value.Under this condition，the degradation rate of β-carotene could reach 93.35%.After being treated by strain HC-3，the  eight flavor components of dihydroactyl lactone， 4，7，9-Mega three ene -3- keton， 4- hydroxyl -β-two hydrogen damascene，9-hydroxy-4，7-Mega three ene ketene，triethyl citrate， 4- （3-hydroxyl butyl） -3，5，5- three methyl -2- cyclohexene -1- ketone，tetradecanoic acid  and neophytadiene in the reconstituted tobacco concentrate were significantly increased.Compared with the untreated reconstituted tobacco concentrate，

0 引言

類胡萝卜素属于质体色素，一般存在于叶绿体结构内部，由8个异戊二烯残基单位构成，是含40个碳原子的萜烯化合物的总称[1-2].作为一种非常重要的天然色素，类胡萝卜素普遍存在于水果（如柠檬、葡萄、菠萝、橙子、草莓等）、蔬菜（如西红柿、红辣椒、胡萝卜等）、鲜花（如花菱草、万寿菊、水仙花等）、部分海洋动物、微生物和昆虫体内，类胡萝卜素也是一种重要的香味前体物质[3-4].依据分子两端化学结构的不同，类胡萝卜素可分为β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、δ-胡萝卜素、ε-胡萝卜素和其他异构体.在烟叶调制、陈化和加工过程中，类胡萝卜素持续的降解作用不但可以提升烟叶中性香味物质的总量，所形成的产物还可进一步经氧化、还原、脱水等化学变化产生更多重要的烟草香味成分[5-6].类胡萝卜素经氧化作用，可分别在C9—C10，C11—C13，C13—C15等双键位置发生断裂[7-10]，生成一系列重要的烟草香味成分，如二氢大马酮、大马酮、二氢弥猴桃内酯、紫罗兰酮、环柠檬醛、氧代异氟尔酮等[11-13].

再造烟叶是利用烟草加工过程中产生的烟草废弃物（烟末、碎烟片、片烟、烟梗等），经过重新加工组合而成的烟叶替代物.其主要加工过程包括烟草原料预处理、水萃取、浓缩、制浆、抄造、涂布、干燥、后处理等.在再造烟叶生产过程中，烟草提取浓缩液的作用是为涂布工序提供香气量充足且质量稳定、性能均一的涂布液，而涂布液的品质又直接决定了再造烟叶产品的内在品质[14-16].目前普遍采用物理方法与化学方法制备烟草浓缩液，但存在香味物质含量低、种类少、副产物较多等问题，而采用微生物技术制备烟草浓缩液，具有转化率高、专一性高、香味物质品质高等优势，因而成为提升再造烟叶浓缩液及其制品品质的重要方法之一.此前有人报道过β-胡萝卜素降解产香菌株，但降解率较低，一般在80%以下[7-8]，也未见β-胡萝卜素降解菌应用于再造烟叶浓缩液的相关报道.

魏涛等[17]从再造烟叶浓缩液中筛选到一株β-胡萝卜素降解产香菌株，为大肠杆菌 HC-3，初步发现其对于β-胡萝卜素具有较好的降解效果.在此基础上，本文拟研究β-胡萝卜素降解菌株HC-3的最佳发酵条件，以获得β-胡萝卜素的最优降解率，并进一步对该菌株发酵液应用于再造烟叶浓缩液的增香效果进行研究，以期解决再造烟叶浓缩液品质较低、利用率较低等相关技术问题.

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 主要材料与试剂

大肠杆菌（Enterobacter sp.）HC-3，由郑州轻工业大学食品与生物工程学院实验室筛选与保存;β-胡萝卜素标样，购于百灵威科技有限公司;β-胡萝卜素（纯度95%），购于陕西帕尼尔生物科技有限公司.

碳源：蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、乳糖和果糖;氮源：NaNO3，（NH4）2SO4，胰蛋白胨和尿素;酵母粉;以上试剂均为分析纯，购于生工生物工程（上海）股份有限公司.

再造烟叶浓缩液TS-01，由河南卷烟工业烟草薄片有限公司提供.

1.1.2 主要培养基

无碳源培养基：K2HPO4 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KCl 0.5 g/L，NaNO3 3 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，β-胡萝卜素15 mg/L.

无碳源无氮源培养基：K2HPO4 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KCl 0.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，β-胡萝卜素15 mg/L.

1.1.3 主要仪器

7890C GC-MS色谱联用仪，美国Agilent公司产;2600 UC/VIS紫外可见分光光度计，美国UNIC公司产.

1.2 实验方法

1.2.1 单因素試验

1.2.1.1 碳源对β-胡萝卜素降解率和菌株细胞干重的影响分析方法 选取无碳源培养基，分别添加蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、乳糖和果糖作为碳源，调整初始pH值为7.0，灭菌制得发酵培养基，在温度30 ℃条件下，摇床150 r/min培养24 h，通过比较不同碳源下菌株细胞干重和β-胡萝卜素降解率，选择发酵培养基的最佳碳源.将该最佳碳源分别以质量浓度10 g/L，30 g/L，50 g/L，70 g/L和90 g/L添加至发酵培养基，在前述条件下对菌株HC-3进行培养，确定其适宜质量浓度.

1.2.1.2 氮源对β-胡萝卜素降解率和菌株细胞干重的影响分析方法 选取无碳源无氮源培养基，在最佳碳源及其最佳质量浓度的条件下，分别添加NaNO3，（NH4）2SO4，胰蛋白胨和尿素作为氮源，调整初始pH值为7.0，灭菌制得发酵培养基，在温度30 ℃条件下，摇床 150 r/min 培养24 h，通过比较不同氮源下菌株细胞干重和β-胡萝卜素降解率，选择发酵培养基的最佳氮源.将该最佳氮源分别以质量浓度1 g/L，3 g/L，5 g/L，7 g/L和 9 g/L 添加至发酵培养基，在前述条件下对菌株HC-3进行培养，确定其适宜质量浓度.

1.2.1.3  酵母粉质量浓度对β-胡萝卜素降解率和菌株细胞干重的影响分析方法 选取无碳源无氮源培养基，在最佳碳源、氮源及其最佳质量浓度的条件下，调整初始pH值为7.0，灭菌制得发酵培养基，将酵母粉分别以质量浓度1 g/L，3 g/L，5 g/L，7 g/L和9 g/L添加至发酵培养基，在温度30 ℃，摇床150 r/min条件下，对菌株HC-3培养 24 h，比较β-胡萝卜素降解率和菌株细胞干重，确定其适宜质量浓度.

1.2.1.4 初始pH值对β-胡萝卜素降解率和菌株细胞干重的影响分析方法 选取无碳源无氮源培养基，添加最佳质量浓度的碳源、氮源和酵母粉，分别调整初始pH值至5.0，6.0，7.0，8.0和9.0，灭菌制得发酵培养基.在温度30 ℃，摇床 150 r/min条件下，对菌株HC-3培养24 h，比较β-胡萝卜素降解率和菌株细胞干重，确定适宜初始pH值.

1.2.1.5 培养温度对β-胡萝卜素降解率和菌株细胞干重的影响分析方法 选取无碳源无氮源培养基，添加最佳质量浓度的碳源、氮源和酵母粉，调整至最佳初始pH值，灭菌制得发酵培养基，分别于20 ℃，25 ℃，30 ℃，35 ℃，40 ℃和45 ℃条件下，摇床150 r/min对菌株HC-3培养24 h，通过比较β-胡萝卜素的降解率和菌株细胞干重，确定适宜培养温度.

1.2.2 正交试验

以单因素试验结果为基础，选取4个影响较大的因素设计L9（34）正交试验，以确定菌株HC-3的最佳发酵条件.

1.2.3 烟支样品的制备

将最佳发酵条件下所得菌株HC-3发酵液和再造烟叶浓缩液TS-01按1GA6FA100的体积比混合处理，在温度为30 ℃，pH值为6.0条件下，摇床150 r/min处理72 h.

将菌株HC-3发酵液处理前和处理后的再造烟叶浓缩液按39%涂布率分别涂布至相应片基上，在90 ℃条件下烘10 min，回潮至水分含量12.5%后切丝卷制成烟支，再将相应烟支在温度（22±2） ℃，相对湿度（ 60 ± 5）%的恒温恒湿箱中平衡 48 h[18].

1.2.4 β-胡萝卜素降解率和香味物质含量的测定方法

采用分光光度计方法测定β-胡萝卜素的降解率，具体方法参见文献[19].采用GC-MS分析方法检测再造烟叶浓缩液中香味物质的含量，具体方法参见文献[17].

1.2.5 感官评价方法

采用文献[20]中的方法对1.2.3制备的烟支样品进行感官评价，以实际评吸结果来检验菌株HC-3发酵液对再造烟叶浓缩液处理后产生的效果.评价小组由15位评委组成.

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 碳源对β-胡萝卜素降解率和菌株细胞干重的影响

碳源对β-胡萝卜素降解率和菌株细胞干重的影响如图1所示.由图1可知，菌株HC-3利用碳源的能力依次为：蔗糖>乳糖>麦芽糖>果糖>葡萄糖，且菌株HC-3利用蔗糖的能力明显优于其他碳源，β-胡萝卜素降解率达到87.5%，菌株细胞干重达到39.2 g/L.这可能是因为蔗糖是一种非还原性双糖，可以被菌株缓慢吸收，为其生长提供必要的碳源和能量，并确保其可以完全降解底物β-胡萝卜素.而葡萄糖是还原性单糖，虽然其可被菌株快速吸收，但会导致菌株对β-胡萝卜素的降解率降低.乳糖和麦芽糖因不易水解故不易被该菌株利用.

在确定最佳碳源为蔗糖后，继续研究蔗糖质量浓度对β-胡萝卜素降解率和菌株细胞干重的影响，结果如图2所示.由图2可知，当蔗糖质量浓度小于30 g/L时，菌株对β-胡萝卜素的降解率较高;当蔗糖质量浓度大于30 g/L时，菌株对β-胡萝卜素的降解率开始缓慢降低.这可能是因为当蔗糖质量浓度高于30 g/L 时，菌株优先利用过量的蔗糖，导致β-胡萝卜素不能很好地被降解;當蔗糖质量浓度为 30 g/L 时，菌株可以正常生长并完全降解底物.因此，选择碳源蔗糖的最佳质量浓度为 30 g/L.

2.1.2 氮源对β-胡萝卜素降解率和菌株细胞干重的影响

氮源对β-胡萝卜素降解率和菌株细胞干重的影响如图3所示.由图3可知，菌株HC-3在氮源为NaNO3的培养基中对β-胡萝卜素降解率最高，达86.1%，同时菌株细胞干重达到39.8 g/L.在确定最佳氮源为NaNO3后，继续研究NaNO3质量浓度对β-胡萝卜素降解率和菌株细胞干重的影响，结果如图4所示.由图4可知，当NaNO3质量浓度低于3 g/L 时，该菌株对β-胡萝卜素的降解率随着NaNO3质量浓度的增加而升高;当NaNO3质量浓度为 3 g/L 时，该菌株对β-胡萝卜素的降解率最高;当NaNO3质量浓度高于3 g/L 时，该菌株对β-胡萝卜素的降解率呈下降趋势.这可能是因为氮源过多，会使菌体生长过于旺盛，pH升高，代谢产物积累困难.因此，选择氮源NaNO3的最佳质量浓度为3 g/L.

2.1.3 酵母粉质量浓度对β-胡萝卜素降解率和菌株细胞干重的影响

酵母粉质量浓度对β-胡萝卜素降解率和菌株细胞干重的影响如图5所示.由图5可知，酵母粉对β-胡萝卜素降解速率的影响非常明显，当酵母粉质量浓度低于3 g/L 时，菌株对β-胡萝卜素的降解能力最高;之后，降解率随着酵母粉质量浓度的增加而显著下降;当酵母粉质量浓度为 9 g/L时，菌株生长最好，但是对底物的降解能力最低.因此，选择酵母粉的最佳质量浓度为3 g/L.

2.1.4 初始pH值对β-胡萝卜素降解率和菌株细胞干重的影响

微生物机体内的反应一般都是酶促反应，而酶促反应都会有一个最适的pH值范围.初始pH值对β-胡萝卜素降解率和菌株细胞干重的影响如图6所示.由图6可知，发酵液的初始pH值对β-胡萝卜素降解率影响极大，在初始pH值小于7.0时，菌株HC-3对β-胡萝卜素的降解能力随pH值的增大而增大;当初始pH值大于7.0时，菌株HC-3对β-胡萝卜素的降解率缓慢下降.因此，选择最佳初始pH值为7.0.

2.1.5 培养温度对β-胡萝卜素降解率和菌株细胞干重的影响

微生物不同的生理活动均要求相应的温度，温度不仅影响酶活还能够影响酶促反应速率.培养温度对β-胡萝卜素降解率和菌株细胞干重的影响如图7所示.由图7可知，温度在35 ℃ 时，降解率达到最高，菌株细胞干重较高，因此，选择最适培养温度为35 ℃.

2.2 正交试验结果

在单因素试验的基础上，选取4个影响较大的因素，即蔗糖质量浓度（A）、NaNO3质量浓度（B）、酵母粉质量浓度（C）和初始pH值（D），设计L9（34）正交试验，正交试验因素水平如表1所示，正交试验结果如表2所示.由表2可知，影响β-胡萝卜素降解率的因素主次为C>B>A>D，即酵母粉质量浓度>NaNO3质量浓度>蔗糖质量浓度>初始pH值.降解率方差分析结果如表3所示.由表3可知，酵母粉质量浓度对β-胡萝卜素降解率影响显著.菌株 HC-3的最佳发酵条件为A3B2C2D1，即蔗糖质量浓度30 g/L，NaNO3质量浓度3 g/L，酵母粉质量浓度3 g/L，初始pH值7.0.经验证，在此最佳发酵条件下，菌株HC-3对β-胡萝卜素的降解率为93.35%.

2.3 再造烟叶浓缩液处理前后的香味成分分析

以菌株HC-3处理前的再造烟叶浓缩液为对照组、菌株HC-3处理后的再造烟叶浓缩液为实验组，菌株HC-3处理前后再造烟叶浓缩液香味成分的变化如表4所示.由表4可知，菌株HC-3处理前后再造烟叶浓缩液中共有46种香味成分发生变化，其中8种主要香味成分含量明显提高，分别为二氢猕猴桃内酯（提高0.616%）、4，7，9-巨豆三烯-3-酮（提高 0.765%）、4-羟基-β-二氢大马酮（提高 0.933%）、9-羟基-4，7-巨豆三烯酮（提高 2.730%）、柠檬酸三乙酯（提高0.535%）、4-（3-羟基丁基）-3，5，5-三甲基-2-环己烯-1-酮（提高0.071%）、肉豆蔻酸（提高0.517%）和新植二烯（提高9.177%）.

2.4 感官评吸结果

再造烟叶浓缩液处理前后的评吸效果如表5所示.由表5可知，与未处理的再造烟叶浓缩液相比，经菌株HC-3处理后的再造烟叶浓缩液综合得分提高0.7分，所得片基香气质较好、香气量较足、香气浓度较高、杂气量较低.

3 结论

本文运用单因素试验和正交试验，对β-胡萝卜素降解菌株HC-3的发酵条件进行了优化，并将最佳发酵条件下得到的菌株HC-3发酵液应用于再造烟叶浓缩液，结合感官评吸考察该菌株的增香效果.结果表明：菌株HC-3发酵降解β-胡萝卜素的最佳条件为NaNO3质量浓度3 g/L，蔗糖质量浓度30 g/L，酵母粉质量浓度3 g/L，初始pH值7.0，在该发酵条件下β-胡萝卜素降解率可以达到93.35%.经该菌株处理后，再造烟叶浓缩液中的二氢猕猴桃内酯、4，7，9-巨豆三烯-3-酮、4-羟基-β-二氢大马酮、9-羟基-4，7-巨豆三烯酮、柠檬酸三乙酯、4-（3-羟基丁基）-3，5，5-三甲基-2-环己烯-1-酮、肉豆蔻酸和新植二烯这8种香味成分含量明显提高;与未处理再造烟叶浓缩液相比，经菌株HC-3处理后的再造烟叶浓缩液制得的片基香气质较好、香气量较足、香气浓度较高、杂气量较低，综合得分提高了0.7分.该β-胡萝卜素降解产生致香物质的新技术有助于提高再造烟叶浓缩液品质和利用率，也为我国再造烟叶生物增香提供了一种新的途径和方法.

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