大风艾药材中总黄酮和3,3′,5,7-四羟基-4′-甲氧基二氢黄酮含量测定

谭道鹏 杜艺玫 秦 琳 鲁艳柳 张倩茹 何芋岐*

1.遵义医科大学药学院，贵州 遵义 563009;2.省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室(贵州医科大学)，贵州 贵阳 550025

大风艾又称艾纳香，为菊科植物艾纳香Blumeabalsamifera的干燥地上部分，具有温中活血、调经、祛风除湿之功效[1]。该药材主要含挥发油(单萜)、黄酮、倍半萜类成分[2]，其中黄酮类成分由黄酮(醇)、二氢黄酮(醇)两种类型组成[3-5]。目前，艾纳香药材主要用于提取艾片(左旋龙脑)，其黄酮类成分也已被开发为中药5类新药，并进入II期临床[4]。黄酮类成分具有多种生物活性，如抗氧化[6]、抗心肌缺血[7]等。为综合开发利用艾纳香中的黄酮类成分，建立快速、准确的艾纳香总黄酮含量测定方法具有重要应用价值。

中国药典中总黄酮含量测定方法主要有分光光度法和高效液相色谱法两种。其中分光光度法又可分为显色后比色法，如山楂叶中总黄酮的含量测定通过加NaNO2-Al(NO3)-NaOH显色[8]，消咳喘糖浆中的总黄酮含量通过AlCl3[8]显色后测定和直接比色法，如淫羊藿中的总黄酮含量测定[8]；高效液相色谱法主要是通过水解后测定主要黄酮苷元，再根据转换系数折算出样品中总黄酮的含量，如银杏叶中的总黄酮醇苷的含量测定[8]。加入AlNO3或AlCl3显色可以使黄酮类成分紫外光谱吸收带I(300～400 nm)波长发生红移，从而避免其他成分的干扰，使得总黄酮测定结果尽可能减少误差，但由于二氢黄酮类成分其吸收带I不明显，不适合采用加Al3+试剂显色法测定含有二氢黄酮类成分的总黄酮含量。直接比色法适用于主要含有一类成分的药材，对于本文中含有两种类型黄酮成分的药材，因其紫外吸收完全不同，以任一类黄酮的最大吸收波长测定其总黄酮含量都会导致其结果偏低。银杏叶中通过水解测定黄酮苷元来折算总黄酮的含量由于经过色谱柱的分离，其结果更为准确，但仅适用于苷元类型相同的黄酮苷类成分。

艾纳香中总黄酮的测定方法也有报道，文献[9]中以芦丁加NaNO2-Al(NO3)-NaOH显色后的于500 nm波长处测定，同样是将黄酮类成分的吸收带I红移后测定的，但艾纳香中除了黄酮(醇)外，还有二氢黄酮类成分[3-5]，而二氢黄酮类成分的吸收带I是不明显的(如图1)，因此，该方法会导致其总黄酮含量测定结果偏低。本实验在前期对艾纳香药材中黄酮类成分研究[3-5]发现其黄酮类成分主要包括黄酮(醇)、二氢黄酮(醇)两种类型，两种不同类型黄酮的紫外吸收图谱完全不同(如图1)，现有文献测定总黄酮含量的方法主要针对单一类型的黄酮类成分，为此，本文拟探索含有两种类型黄酮的艾纳香中总黄酮含量的紫外测定方法，为以艾纳香总黄酮作为有效成分的制剂原料药材的质量控制提供参考。

艾纳香药材中单体有效成分的含量测定也有报道，如：艾纳香素和二氢黄酮醇[10]、原儿茶酸[11]等，但这些成分在艾纳香中的含量并不高，而含量较高的3,3′,5,7-四羟基-4′-甲氧基二氢黄酮的含量测定方法尚未见报道，并且药理活性研究表明3,3′,5,7-四羟基-4′-甲氧基二氢黄酮对非小细胞肺癌A549细胞增殖和转移有显著抑制作用[12]，本文对其进行了HPLC含量测定方法学研究。

1 仪器和试药

岛津UV-2401PC型紫外分光光度计，Agilent 1100 series 高效液相色谱仪(在线脱气、自动进样、VWD检测器、Agilent Chemistation for LC system 色谱工作站)。

芦丁对照品(批号100080-200707)购自中国药品生物制品检定院，3,3′,5,7-四羟基-4′-甲氧基二氢黄酮对照品(批号20150801)为自制，纯度经NMR、HPLC检测，其他试剂为分析纯。

艾纳香药材分别购自广西、贵州，经作者鉴定为艾纳香Blumeabalsamifera，样品标本保存于遵义医科大学药学院标本室。

2 方法与结果

2.1 总黄酮含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取3,3′,5,7-四羟基-4′-甲氧基二氢黄酮适量，加甲醇制成1 mL中含0.4 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取艾纳香药材粉末0.2 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，称定重量，回流提取60 min，放冷，再称定重量，以80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品母液，精密吸取供试品母液3 mL，以80%甲醇稀释到100 mL，作为供试品溶液。

2.1.3 测定波长的选择 艾纳香中的黄酮类成分由黄酮(醇)、二氢黄酮(醇)四种类型组成，其中，黄酮(醇)类化合物有两个紫外吸收带，峰带I(300～400 nm)和峰带II(200～280 nm)，代表性化合物如芦丁；二氢黄酮(醇)类化合物的峰带I很弱，主峰带II(270～295nm)，代表性化合物如3,3′,5,7-四羟基-4′-甲氧基二氢黄酮；等浓度的芦丁与3,3′,5,7-四羟基-4′-甲氧基二氢黄酮在271 nm处有相等的吸光度(如图1)，而艾纳香中的另外两类主要成分：挥发油(单萜)、倍半萜因缺少共轭系统在271 nm不会产生干扰。因此，选择271 nm为测定波长，采用紫外分光光度法测定艾纳香中的总黄酮含量。

2.1.4 标准曲线的绘制 精密吸取3,3′,5,7-四羟基-4′-甲氧基二氢黄酮对照品溶液0、1、2、3、4、6、8 mL置50 mL量瓶中，加80%甲醇稀释至刻度，摇匀，以0 μg/mL对照品溶液为空白，在271 nm处测定上述系列对照品溶液的吸光度。以吸光度y为纵坐标，浓度x(μg/mL)为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为：y=23.646x+0.0038；R2=0.9997。结果表明：3,3′,5,7-四羟基-4′-甲氧基二氢黄酮在8.26～66.05 μg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.1.5 精密度试验 取艾纳香药材1份，按“2.1.2”项下操作，制备成供试品溶液，连续测定5次，由吸收度计算RSD为0.04%。

2.1.6 重复性试验 取同一批次艾纳香药材6份，按“2.1.2”项下操作，制备成供试品溶液，分别测定吸收度，并计算出样品中总黄酮平均含量为12.1%，RSD为1.69%。

2.1.7 稳定性试验 取艾纳香药材1份，按“2.1.2”项下操作，制备成供试品溶液，在一定时间段内(0, 15, 30, 60, 120, 180, 240 min)测定吸收度，计算RSD为0.10%，结果表明供试品溶液在240 min内稳定。

2.1.8 加样回收率试验 精密称定已知总黄酮含量的艾纳香药材6份，分别加入3,3′,5,7-四羟基-4′-甲氧基二氢黄酮对照品，按“2.1.2”项下操作，制备成供试品溶液，分别测定吸收度，并计算出平均加样回收率为100.51%，RSD为2.57%。

2.2 3,3′,5,7-四羟基-4′-甲氧基二氢黄酮含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备 精密吸取总黄酮测定项下的对照品溶液2 mL，加80%甲醇稀释到10 mL，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取总黄酮测定项下的供试品母液作为供试品溶液。

2.2.3 色谱条件及适用性试验 色谱柱：AKZONOBEL Kromasil 100-5C18(4.6×250 mm,5 μm)；流动相为甲醇(A)-0.4%磷酸(B)，梯度洗脱(0～10 min, 45%A; 10～20 min, 80%A)；流速：1.0 mL/min；检测波长：289 nm；柱温：30℃；进样量：10 μL。色谱图如图2所示。

2.2.4 线性关系考察 精密称定3,3′,5,7-四羟基-4′-甲氧基二氢黄酮对照品适量，配置成浓度分别为2.06、4.12、10.32、20.64、41.28、123.84、412.8、825.6 μg/mL的系列对照品溶液，分别精密吸取10 μL，进液相测定，以峰面积y为纵坐标，浓度x(μg/mL)为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为：y=32.418x+27.17；R2=1。结果表明：3,3′,5,7-四羟基-4′-甲氧基二氢黄酮在2.06～825.6 μg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.2.5 精密度试验 取艾纳香药材1份，按“2.1.2”项下操作，制备成供试品溶液，连续测定5次，根据峰面积计算RSD为0.62%。

2.2.6 重复性试验 取同一批次艾纳香药材6份，按“2.1.2”项下操作，制备成供试品溶液，分别测定，并计算出样品中3,3′,5,7-四羟基-4′-甲氧基二氢黄酮平均含量为1.2%，RSD为1.85%。

2.2.7 稳定性试验 取艾纳香药材1份，按“2.1.2”项下操作，制备成供试品溶液，在一定时间段内(0, 1, 2, 4, 8, 12, 18 h)测定峰面积。结果表明供试品溶液在18 h内稳定，RSD为0.40%。

2.2.8 加样回收率试验 精密称定已知总黄酮含量的艾纳香药材6份，分别加入3,3′,5,7-四羟基-4′-甲氧基二氢黄酮对照品，按“2.1.2”项下操作，制备成供试品溶液，分别测定，并计算出平均加样回收率为101.74%，RSD为3.00%。

2.2.9 样品测定 取3批艾纳香药材分别按上述方法测定其总黄酮及3,3′,5,7-四羟基-4′-甲氧基二氢黄酮含量，结果见表2。

表1 总黄酮和3,3′,5,7-四羟基-4′-甲氧基二氢黄酮加样回收率

表2 不同批次艾纳香药材中总黄酮和3,3′,5,7-四羟基-4′-甲氧基二氢黄酮含量

3 讨论

分光光度法是一种中药总成分分析的常用方法，但由于中药中的成分非常复杂，采用分光光度法测定某一类总成分时极易受到其它类成分的干扰，因此需要对样品中的化学成分充分的了解，选择出适合的方法以保证方测定结果的准确性。黄酮类成分是自然界普遍存在一种重要天然产物，黄酮类成分具有多种多样的活性，一直受到天然药物研究学者的关注。黄酮类成分根据其结构又可细分为多种类型，如黄酮(醇)、二氢黄酮(醇)、查尔酮、黄烷、双黄酮等，艾纳香药材中含有丰富的黄酮类成分，主要以黄酮(醇)、二氢黄酮(醇)两种类型为主。这两种类型的黄酮紫外吸收图谱完全不同(如图1)，从图中可以看出以任何一种类型黄酮类成分的最大吸收波长测定其总黄酮含量都会因另一种黄酮类成分在相应的最大吸收波长处的吸收值较低而造成测定结果较实际含量低。等吸收波长是指在某一波长处相同浓度的两种化学成分具有相同的紫外吸收值，通过配置相同浓度的两种化学成分分别绘制其紫外吸收图谱叠加后，在其紫外吸收图谱交叉处即为这两种化学成分的等吸收波长。由于相同浓度的不同类型化学成分在等吸收波长处的吸收值是相同的，因此可采用等吸收波长不经分离，直接同时测定不同类型化学成分的含量[13- 14]，并减少误差。通过本实验发现芦丁与3,3′,5,7-四羟基-4′-甲氧基二氢黄酮有三个等吸收波长，其中271 nm具有较好的吸收，同时又可避免末端波长的干扰，因此选作本实验测定波长测定艾纳香中不同类型黄酮的总含量，方法学研究结果表明该方法准确、方便、快捷，可以作为药材、中间体及制剂的控制方法。

实验过程中分别对总黄酮及3,3′,5,7-四羟基-4′-甲氧基二氢黄酮的提取条件进行了考察，结果表明0.2 g艾纳香药材采用25 mL80%甲醇回流提取1 h可以提取完全。本实验对艾纳香药材中的总黄酮及主要黄酮单体化学成分3,3′,5,7-四羟基-4′-甲氧基二氢黄酮的测定结果发现其含量分别达到7.2～12.3%及0.8～1.4%，具有非常高的开发利用前景。