基于网络药理学及分子对接筛选大血藤防治类风湿性关节炎的关键靶点及活性成分

陈平男 杨 欣 卢筱潇 张 宁 崔 瑾*

1.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550002；2.成都中医药大学，四川 成都 610072

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)为自身免疫疾病，主要表现为多关节炎、关节肿痛、软骨和骨破坏和关节畸形等。目前，研究者不断研究与开发防治RA的药物[1]，包括中药、单体及中药复方[2]。中药在防治RA疾病中发挥重要作用，中药的毒副作用较少，凸显其在RA中的作用优势。中药单体、复方防治RA均有报道。曾光等[3]研究熊果酸对RA及骨质破坏具有一定的作用；黄明进等[4]发现黑骨藤具有防治RA的作用；李健等[5]采用中药方剂治疗类风湿关节炎。中药化学成分诸多，活性成分与靶标蛋白结合，对疾病的治疗中发挥协同作用，但是中药的活性成分经过提取分离，从分子水平(蛋白、基因)探讨其药理作用的过程比较复杂。随着科学技术的不断提高，多学科的交叉，分子对接迅速发展,在中医药中广泛应用[6]。分子对接将中药、中药复方、天然产物等小分子与疾病的关键靶点(蛋白)进行几何匹配和能量匹配。查找空间和能量与之最佳契合的生物大分子,是快速的发现药物作用潜在靶标的新方法[7]。

大血藤为大血藤科藤本植物大血藤(Sargentodoxacuneata(Oliv) Rehd.et Wils.)的干燥藤茎、根，又称为“血藤”。用药历史悠久，临床应用广泛,具有活血散瘀、强筋骨、止痛通经的功效。目前，大血藤主要集中在抗菌、抗炎、抗病毒等药理作用[8]。但是大血藤抗炎活性成分及靶标蛋白并不清楚，因此对其化学成分进行了进一步的研究，为中药开发及中药活性成分应用提供理论依据。以研究大血藤抗RA的活性成分及机制为目的，从整体层面，运用分子对接结合网络药理学，阐释中药功能描述与现代药理之间的关系。

1 实验方法

1.1 类风湿性关节炎靶点筛选 RA的潜在靶标基因通过CTD进行筛选，在线打开CTD，在疾病名称中输入“Arthritis, Rheumatoid”为关键词检索RA的相关靶点，选择已经有实验验证的“M”或“T”为靶标，统计RA靶点的数量。

1.2 通路分析 基于DAVID(https://david. ncifcrf.gov/)和KOBAX3.0(KEGG Orthology Based Annotation System)对RA靶标基因进行通路富集分析，DAVID是基于WEB服务器的富集分析软件。对RA靶点进行GO功能、通路和疾病分析等；KOBAS软件的功能模块中有ID Mapping，将RA基因通过数据库富集到相应的通路中。分析结果得到RA靶点参与的通路途径，选择RA靶点显著参与的途径(P≤0.01)，基于Rstudio软件中的ggplot 2绘制气泡图，包括通路名称、富集分析的P值、Rich factor和Q值等。

1.3 相互作用分析 采用STRING结合Cytoscape 3.5.1对RA通路中16个RA靶点进行相互作用分析，STRING是蛋白质相互作用数据库，可进行是搜索已知蛋白之间和预测蛋白质之间相互作用，通过蛋白质名称进行检索16个蛋白质相互作用的相关性。

1.4 大血藤活性成分筛选 大血藤小分子化合物基于中药系统药理学数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology ,TCMSP)下载[9]，通过大血藤名称查找活性成分。对大血藤关键化学成分进行分子量(MW)、氢键供体数(Hdon)、氢键受体数(Hacc)、生物利用度(OB)、血脑屏障(BBB)、药物对小肠上皮细胞的穿透性和类药性等进行分析。基于SYBYL2.1.1对大血藤活性成分进行加氢和加电荷[10]，对活性成分进行 Minimize 能量优化，保存为SLN格式。

1.5 分子对接 采用SYBYL2.1 软件的Surflex-Dock 模块对大血藤活性成分与RA靶点进行分子对接研究[11]。从蛋白质晶体结构数据库RCSB (http://www.rcsb.org/pdb ) 下载白细胞介素-6(PDBID∶1ALU)、人白介素1β(PDBID∶1RWN)、肿瘤坏死因子(PDBID∶2AZ5)、toll样受体2(PDBID∶1FYW)、白细胞介素18(PDBID∶3WO2)、白细胞介素23A(PDBID∶3QWR)、人集落刺激因子2(PDBID∶5C7X)、干扰素-γ(PDBID∶1EKU)、血管内皮生长因子A(PDBID∶3BDY)和细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(PDBID∶3OSK)3D 晶体结构。选择原配体模式产生活性口袋，分子对接结果以Total-Score>5为阈值。

2 实验结果

2.1 类风湿性关节炎靶点筛选及通路分析 基于CTD 筛选类风湿性关节炎靶标基因，以“Arthritis, Rheumatoid”为关键词检索类风湿性关节炎的相关靶点，选择已经有实验验证的“M”或“T”为靶标，共筛选出175个RA的靶标基因。

采用DAVID 对RA靶点进行通路分析，得到RA靶点参与的所有途径，筛选出RA靶点显著参与的通路途径(P<0.01)，175个RA靶点参与38条代谢途径，输出前10条通路(图1)，包括RA通路(P-Value=2.01E-11)。采用KOBAX对RA靶点进行通路分析，175个RA靶点参与85条代谢途径，输出前10条通路(图2)，包括RA通路(P-Value=6.04E-20)。

RA通路中包括16个靶标基因(TNF、IL-6、TLR2、IL1β、IL18、IL23A、CSF2、VEGF2、IFNG、CTLA4、CXCL8、CD28、 CXCL6、HLA-DPB1、HLA-DRB1、HLA-DQA2)，两个数据库RA通路中靶标基因具有一致性。

2.2 RA通路靶点相互作用分析 采用STRING结合Cytoscape 3.5.1对RA通路中16个靶标基因进行相互作用分析，结果显示整个网络关联紧密。图3表明： TNF、VEGFA 、CTLA4和 IFNG等为中心靶点，去掉后，整个网络涣散。

2.3 类风湿性关节炎的关键靶标蛋白 通过蛋白相互作用分析，根据degree(度)的大小，选择有实验数据支持的靶点进行分子对接，对关键靶标进行生物学效应分析[12-13]。详见表2。

表2 关键靶标的基本信息

2.4 分子对接结果 本次研究将处理好的 23个小分子分别与 10个靶标蛋白进行能量匹配，原配体与10个靶标蛋白结合的总分为42.5，选择总分大于42.5且与靶点结合的数量大于7为抗类风湿性关节炎的活性成分。通过筛选明确大血藤化学成分谷甾醇(MOL000359)与7个靶点(IL-6、TNF、IL1B、IL18、CSF2、VEGFA、TLR2)结合较好，且分子对接总分为43；毛柳甙(MOL003341)与7个靶点(L-6 、TNF、IL1B、IL18、IL23A、VEGFA、IFNG)结合较好，且分子对接总分为49；内消旋二氢愈创木酯酸(MOL007920)与7个靶点(TNF、IL1B、IL18、IL23A、CSF2、VEGFA、TLR2)结合较好，且分子对接总分为48。谷甾醇、毛柳甙、内消旋二氢愈创木酯酸为大血藤发挥抗类风湿性关节炎的关键活性成分。

大血藤23个化学成分，其中11个化学成分能调节肿瘤坏死因子(TNF)、血管内皮生长因子A(VEGFA)；9个化学成分能调节白介素1β(IL1β)；8个化学成分能调节toll样受体2(TLR2)。肿瘤坏死因子、血管内皮生长因子A、白介素1β、toll样受体2为大血藤治疗类风湿性关节炎的关键靶标蛋白。详见图4。

2.5 关键化学成分的理化性质 大血藤抗RA的关键活性成分谷甾醇、毛柳甙、内消旋二氢愈创木酯酸进行ADME/T性质分析。根据Lipinski规则，化合物应该具备氢键受体数(Hacc)<10，分子量(MW)<500，氢键供体数(Hdon)<10，生物利用度(OB)≥30%，药物对小肠上皮细胞的穿透性≥-0.4，血脑屏障(BBB)≥-0.3，类药性≥0.18。如果过多参数不符合，会影响药物的溶解性及肠吸收能力，谷甾醇、内消旋二氢愈创木酯酸、毛柳甙基本遵循Lipinski规则(表3)。谷甾醇、内消旋二氢愈创木酯酸、毛柳甙的化学结构详见图5。

表3 关键化学成分物理化性质

注：A 谷甾醇 B毛柳甙 C Meso-dihydroguaiaretic acid。

3 讨论

本研究从大血藤活性成分、RA靶点、通路、相互作用等几个方面进行讨论。RA是一种慢性自身免疫性疾病，越来越多的证据表明，RA的病理生理机制非常复杂，多种生物学过程和多条信号通路参与了RA损伤进程。本研究筛选出的175个RA靶点主要参与TNF，Toll-like receptor 等通路释放炎性细胞因子及促炎因子。大血藤可能通过多成分-多靶点或多成分-单靶点干预炎症、免疫通路减少炎性细胞因子与促炎因子的释放。本研究通过网络药理学结合分子对接技术，系统筛选大血藤治疗RA可能的活性成分及分子机制，为治疗RA提供新的切入点。本研究仅初步阐释了其合理性，尚存在一些局限性。

目前，多种生物制剂在RA的治疗环节中发挥作用[14]。但是RA疾病反复发作，尚未有根治的方法，临床上存在治疗难点。RA的发病机制非常复杂，并不是单条通路发挥作用，而是多条通路共同作用，需要不断研究防治RA的靶向药物。本研究采用分子对接明确大血藤通过多成分-多靶点协同治疗类风湿性关节炎，11个活性成分与血管内皮生长因子A(VEGFA)和肿瘤坏死因子(TNF) 有较好的结合；9个活性成分与白介素1β ( IL1β )有较好的结合；8个化学成分能调节toll样受体2(TLR2)。已经有研究者发现大血藤对佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞MMP-9、MMP-2、血清TNF-α和IL-6有调节作用[15-16]。RA的发生、发展与多种细胞因子相关，已经有研究表明：TNF为RA发病的主要促炎因子之一，促进炎症持续反应，软骨及骨的破坏，已经开发抗TNF-α药物[17]。VEGFA为血管生成促进因子之一，主要影响器官的发育、组织再生、血管渗透等[18]。IL是致炎性因子，促进大量炎症细胞的聚集，开发抑制IL的表达已经成为治疗RA的新方法[19]。总之，TNF、VEGFA、IL1β和TLR2可能为大血藤治疗类风湿性关节炎的关键靶标蛋白，为动物实验提供理论依据。同时通过本次研究发现:谷甾醇、毛柳甙、内消旋二氢愈创木酯酸为大血藤发挥抗类风湿性关节炎的关键活性成分。已经有研究表明:毛柳甙具有抗肿瘤、抗衰老、心血管保护和调节免疫等广泛的药理活性[20-21]；谷甾醇为植物界最普遍存在的甾醇，在降血胆固醇、抗炎、抗肿瘤等药理作用中发挥重要作用。本研究初步明确了大血藤抗类风湿性关键炎的关键靶点及活性成分。