金钗石斛居群内石斛碱的含量差异比较

陆安静，余丹丹，何慧雨，杜艺玫，张倩茹，白朝钧,杨 洲，杨继勇，

谭道鹏1，何芋岐1

(1.遵义医科大学药学院基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 563099；2.贵州纳蒂尔生物科技有限公司，贵州 贵阳 550009；3.广州市凌瀚医药科技有限公司，广东 广州 510080；4.上海诗丹德标准技术服务有限公司,上海 201203；5.赤水市信天中药产业开发有限公司，贵州 赤水 564700)

石斛(Dendrobium)为兰科(Orchidaceae)石斛属(DendrobiumSw.)多年附生草本植物，是我国传统名贵中药材之一。《神农本草经》将其列为上品，称其有“强阴益精、厚肠胃、补内孢不足、轻身延年”之功效。金钗石斛(DendrobiumnobileLindl)，又名扁金钗、扁黄草、扁草等，是现行版《中国药典》石斛药材的首要来源[1]。研究表明，金钗石斛中含有生物碱、联苄、多糖、芴酮、酚类、倍半萜等多种有机小分子化合物[2-7]，其中生物碱(DendrobiumnobileLindl.alkaloids，DNLA)是《中国药典》中金钗石斛的质量控制成分。药理学研究表明，金钗石斛中生物碱具有保护神经、抗白内障、抗肿瘤、降血糖和血脂等药理作用[8-11]。石斛碱是石斛生物碱的特征化学成分[12]，现行《中国药典》以石斛碱含量作为评判金钗石斛质量的指标，规定石斛碱含量不得低于0.4%。

金钗石斛的人工栽培始见于明代，《本草纲目》记载“其茎状如金钗之股，故古有金钗石斛之称。今蜀人栽之，呼为金钗花。……开红花”，贵州省赤水市在明代隶属于四川行省之遵义军民府，属于《本草纲目》中所称蜀中地区。1978年王用平介绍的贵州赤水县金钗石斛的栽培方法[13]是石斛药材现代人工栽培最早报道之一。因此，贵州赤水的金钗石斛人工栽培具有非常悠久的历史传承。迄今，赤水已建成国内最大的金钗石斛附石仿野生栽培基地，并且取得了国家地理标志产品保护。目前，赤水当地金钗石斛采收习惯是剪取2～3年生枝条，而非整体采收。但对于居群内不同枝条之间石斛碱含量的对比分析却少见报道。不清楚居群内不同枝条石斛碱含量，势必对金钗石斛药材、下游饮片及深加工产品的品质造成影响。为深入研究金钗石斛的品质影响因素，本文根据2015版《中国药典》中石斛碱含量测定方法对贵州赤水市复兴镇凯旋村金钗石斛居群内，不同丛、不同枝条的仿野生金钗石斛中石斛碱含量进行比较分析，发现金钗石斛居群内石斛碱含量存在显著差异，可以为金钗石斛的种植采收工艺的标准化提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 气相色谱仪(安捷伦7820型气相色谱仪，FID检测器)，电子分析天平(万分之一，梅特勒-托利多仪器有限公司)，电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)，恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)，石斛碱对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111876201704)，萘(西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，批号：BCBZ3690)，高纯氮(99.99%)，甲酸(分析纯，成都市科隆化学品有限公司)，甲醇(分析纯，成都市科隆化学品有限公司)，金钗石斛(54个仿野生金钗石斛样本采自贵州赤水市凯旋村，经遵义医科大学附属医院中药房杨建文主任药师鉴定为兰科植物金钗石斛(DendrobiumnobileLindl，样本具体信息见表1)。

表1 金钗石斛样本信息

丛数样本编号生长年限海拔(米)第1丛CS201910101-1～ 31年生589.4CS201910101-4～ 62年生CS201910101-7～ 93年生第2丛CS201910102-1～ 31年生584.8CS201910102-4～ 62年生CS201910102-7～ 93年生第3丛CS201910103-1～ 31年生560.7CS201910103-4～ 62年生CS201910103-7～ 93年生第4丛CS201910104-1～ 31年生551.0CS201910104-4～ 62年生CS201910104-7～ 93年生第5丛CS201910105-1～ 31年生538.0CS201910105-4～ 62年生CS201910105-7～ 93年生第6丛CS201910106-1～ 31年生545.3CS201910106-4～ 62年生CS201910106-7～ 93年生

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 DB-1毛细管柱(柱长为30 m，内径为0.25 mm，膜厚度为0.25 μm)，程序升温的初始温度为80℃，以每分钟10℃的速率升温至250℃，保持5 min；进样口温度为250℃，检测器温度为250℃，载气流速1 mL/min，进样量为1 μL，空气流量300 mL/min，氢气流量30 mL/min，尾吹气25 mL/min，分流比为1∶1。按上述色谱条件进行分析得其色谱图，见图1。

1.2.2 溶液的制备 ①内标及对照品溶液的制备：取萘标准品约12.5 mg，精密称定，甲醇定容至10 mL，摇匀，制成每1 mL含1.25 mg萘的储备液，4℃保存；精密量取1 mL，甲醇定容至50 mL，制成25 μg/mL的内标溶液。取石斛碱对照品约5.0 mg，精密称定，甲醇定容至5 mL，制成每1 mL含1 mg石斛碱的储备液，摇匀，4℃保存；精密量取储备溶液0.25 mL，加甲醇定容至5 mL，制成浓度为50 μg/mL的石斛碱溶液。取50.0 μg/mL的石斛碱溶液2 mL，25.0 μg/mL的内标溶液1 mL，加甲醇定容至5 mL，即得对照品溶液。②供试品溶液的制备：取供试品(金钗石斛鲜品干燥后，粉碎，过3号筛)约0.25g，精密称定，置于100 mL圆底烧瓶中，用移液管精密加入0.05%甲酸-甲醇溶液25.0 mL，称定重量；水浴提取3 h(80℃)，放冷，用0.05%甲酸-甲醇溶液补足失重。提取液滤过，精密量取续滤液2.0 mL，加内标溶液1 mL，用0.05%甲酸-甲醇溶液定容至5 mL，摇匀，即得供试品溶液。

A：对照品；B： 供试品; 1:萘；2:石斛碱 图1 石斛碱对照品及金钗石斛供试品的气相色谱图

1.2.3 方法学考察

1.2.3.1 标准曲线 精密量取100 μg/mL对照品溶液，制成含石斛碱浓度分别为0.3、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6、19.2、38.4、50 μg/mL 的对照品溶液，记录峰面积。以浓度(X)为横坐标，峰面积比值(对照品峰面积/内标物峰面积)(y)为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线。标准曲线方程为y=0.1503x- 0.0293(R2=0.9999)，线性关系良好，说明石斛碱在0.3～50 μg/mL具有良好的线性关系。

1.2.3.2 精密度试验 取同一份对照品溶液，连续进样6次，记录色谱峰面积比值(对照品峰面积/内标物峰面积)，RSD为0.5%，表明精密度良好。

1.2.3.3 重复性试验 取同一批样品，按1.2.2项下方法平行制备6份供试品溶液，记录色谱峰面积比值(对照品峰面积/内标物峰面积)，计算石斛碱含量，RSD为1.5%，表明该方法重复性良好。

1.2.3.4 稳定性试验 取同一份供试品溶液分别在0、2、4、8、12、24、48 h进样，记录色谱峰面积比值(对照品峰面积/内标物峰面积)，RSD为0.4%，表明供试品溶液在48h内稳定。

1.2.3.5 回收率试验 称量同一批已知含量(0.36%)供试品约0.125 g，共6份。按1∶1比例准确加入石斛碱对照品溶液(0.45 mg/mL)，按照1.2.2项下方法制备供试品溶液，记录色谱峰面积比值(对照品峰面积/内标物峰面积)，计算其平均回收率为90.3%，RSD%为2.4%，结果(见表2)。

表2 回收率试验结果

称样量(g)样品中量(mg)加入量(mL)测得量(mg)回收率(%)平均值(%)RSD(%)0.12520.45071.00000.863791.890.32.40.12530.45111.00000.865292.00.12530.45111.00000.845587.70.12540.45141.00000.866092.10.12540.45141.00000.860791.00.12540.45141.00000.845187.5

1.2.4 含量测定 吸取按1.2.2项下制备的供试品溶液1μL，注入气相色谱仪，按1.2.1项下色谱条件测定。

2 结果

2.1 金钗石斛居群内不同丛、不同年生枝条中石斛碱含量整体情况可视化分析 以生长年限为横坐标，石斛碱百分含量为纵坐标对54个样本进行分析，观察不同丛、不同年生枝条金钗石斛中石斛碱含量差异及合格情况。结果如图2所示，图中每个点代表每一个样本，不同颜色代表不同生长年限，不同形状代表不同海拔，水平黑线为中国药典规定的金钗石斛中石斛碱含量的标准限0.4%，低于此线代表不合格。由图2可得，不同丛、不同枝条中石斛碱含量均有差异，第3丛年生3-3号样本的石斛碱含量为最高，含量为0.94%，第6丛年生6-9号样本石斛碱含量最低，含量为0.13%。同一丛样本、不同枝条中石斛碱含量差异主要受生长年限影响。不同丛样本间石斛碱含量差异主要受地势因素影响。54个样本中，石斛碱含量符合药典标准样本的有20个。不同生长年限、不同地势因素下合格样本分布情况不一样。其中，1年生、2年生、3年生石斛碱含量合格样本比例分别为78%、28%、6%；高地势、低地势石斛碱含量合格样本比例分别为56%、19%(见图3)。

图2 金钗石斛中石斛碱含量整体情况散点分析图

A：1年生；B：2年生；C：3年生；D：高地势；E： 低地势。图3 不同生长年限、不同地势石斛碱含量合格率

2.2 同一丛中不同年生枝条石斛碱含量差异分析 根据整体可视化分析结果可知，生长年限是同一丛中不同茎条石斛碱含量差异的主要因素，进一步进行统计分析。由图4可得，不同生长年限下生长的金钗石斛中石斛碱含量具有差异且有规律性，随着时间的推移，石斛碱含量逐渐下降，1年生>2年生>3年生。第1丛样本中，3年生枝条石斛碱含量较两年生枝条显著降低(P<0.05)；第2丛样本中，2、3年生枝条石斛碱含量分别较1年生枝条显著降低(P<0.05)；第3丛、第6丛样本中，与1年生枝条相比，2、3年生枝条石斛碱含量显著降低，且3年生较2年生显著降低(P<0.05)；第4丛与第5丛样本中，随着生长年限的延长，石斛碱含量逐渐降低，无显著性差异。

a：2年生与1年生相比，P<0.05；b：3年生与1年生相比，P<0.05；c：3年生与2年生相比，P<0.05；n=3。图4 不同生长年限下金钗石斛中石斛碱含量的变化

2.3 不同丛金钗石斛中石斛碱含量差异分析 根据整体可视化分析，进一步对不同丛金钗石斛中石斛碱含量进行分析。图5，第1～3丛金钗石斛药材采自高地势，第4～6丛金钗石斛药材采自低地势，不同丛石斛碱含量均有差异，与第1、3丛相比时，第4、5、6丛中石斛碱含量分别显著降低(见图5，P<0.05)。进一步分析不同地势对石斛碱含量的影响，对同1生长年限下不同地势的石斛碱含量进行统计分析，结果表明，1、2、3年生金钗石斛中，高地势石斛碱含量高，与低地势相比，均有显著性差异(见图6，P<0.05)。

a：与第一丛相比，P<0.05 ；b：与第3丛相比，P<0.05；n=9 。图5 不同丛金钗石斛中石斛碱含量的变化

a：与低地势相比，P<0.05；n=9。图6 不同地势金钗石斛中石斛碱含量差异比较

3 讨论

石斛碱是金钗石斛中的主要有效成分，其含量是评估金钗石斛药材内在品质的主要标准。中国药典规定，按干燥品计算，石斛碱含量不得少于0.4%。已有文献报道，不同生长地、采收月份、生长年限、生长部位等因素与石斛碱含量的关系[14-15]。但未见有金钗石斛居群内丛与丛之间、同丛内不同年生枝条石斛碱含量差异的相关报道。本实验结果表明，金钗石斛居群内同一丛中不同条金钗石斛中石斛碱均有明显差异，并且有较多样本中石斛碱含量未能达到中国药典规定要求。不同样本中石斛碱的含量与生长年限高度相关，不同年生枝条的石斛碱含量具有一定的规律性：1年生>2年生>3年生，这与颜寿等[16]的研究结果基本一致。金钗石斛药材一般2～3年采收，但据不同生长年份的金钗石斛中石斛碱含量对比研究结果，1年生金钗石斛符合药典标准的比例为78%，两年生样本次之，28%符合药典标准，3年生样本仅有6%符合药典标准，因此金钗石斛药材的采收有必要合理安排采收时间。

在生长年限相同的条件下，不同丛金钗石斛中石斛碱含量也均有所不同(见图2)，结合地势因素，高地势金钗石斛中石斛碱含量明显高于低地势金钗石斛的石斛碱含量。因此，今后金钗石斛的栽培需要对地势进行选择。

本研究通过对金钗石斛居群内不同丛、不同年生金钗石斛枝条中石斛碱含量对比研究发现，居群内金钗石斛药材中石斛碱含量存在明显差异，并且直接关系到药材质量的合格与否，这对于金钗石斛批次内药材的质量控制带来较大挑战，为保障金钗石斛药材的品质稳定性，有必要对金钗石斛批次内药材增加抽检样品范围，同时在种植源头的地域、地势等栽培条件及生长年限等采收条件进一步细化规范。