陕西省健康人群脑膜炎奈瑟菌带菌率调查及其血清群分布特征

胡伟军 王锐泽 王月祺 张少白

陕西省疾病预防控制中心（西安710054）

脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis，Nm）简称为脑膜炎球菌（meningococcus），是流行性脑脊髓膜炎（简称流脑）的病原菌。流脑属于急性呼吸道传染病，常在冬春季节发病，早期极易被误诊，即使得到及时诊断并治疗，仍有8%～15%的病死率，20%的幸存者会出现严重的后遗症，且婴儿、儿童和青少年高发，疾病危害严重。Nm 根据其荚膜多糖抗原群特异性，可分为13 个血清群（A、B、C、D、E、H、I、K、L、W、X、Y、Z），其中6 个血清群（A、B、C、W、X、Y）在全球细菌性脑膜炎疾病中最为流行［1-5］。

中国在1938-1977年间经历了5 次流脑流行，其中1967年发病率最高（403/10 万），病死率约为5.5%［6］。20 世纪80年代中国大规模的接种A 群多糖流脑疫苗及2008年政府将A+C 群多糖流脑疫苗纳入免疫规划后，中国的病例报告数显著下降，但仍存在局部暴发流行。Nm 在亚洲主要流行株为A 群和C 群，偶有B、W 和Y 群流行。在中国，Nm 流行株近10年发生较大变化，A 群病例比例明显下降，C 群先升高后降低，B、W 群及未分群病例上升趋势明显［7-8］。

研究显示流脑健康人群带菌情况与疾病的发病具有明显的关联性。目前，陕西省健康人群脑膜炎奈瑟菌携带情况及其菌群分布的基础资料较少。为了解陕西省健康人群脑膜炎奈瑟菌携带状况，及时采取有效防治措施，本研究于2016年10月至2017年7月选取4 个地市开展了健康人群Nm 带菌率调查，现将调查结果报道如下。

1 对象与方法

1.1 抽样对象和抽样方法本研究根据陕西省地域和气候特征，在陕北地区选择延安市，关中地区选择西安市和宝鸡市（关中地域狭长且人口较多），陕南地区选择安康市开展调查，其中西安市和宝鸡市各随机选取两个县，延安市和安康市各选取一个县开展调查。调查区县随机抽取两个乡镇，人群按年龄分层采取整群随机抽样，分0 ～2、3 ～5、6 ～14、15 ～24、25 ～44 及≥45 岁6 个年龄段采集血清标本，调查对象在接受调查时均为健康个体。文献报道我国部分地区Nm 带菌率约为30%，p 以此预估，取容许误差d = 0.1 p，设计效应系数deff = 1.25，估算样本量n= 1 120 例。样本量计算公式= 1 120（人）。每个地市每个年龄段采样对象不少于40 例，总人数不少于240 例，男女比例均衡。

1.2 主要试剂和仪器标本采集使用COPAN 公司的咽拭子，细菌培养采用巧克力双抗培养基和哥伦比亚血平板，核酸提取使用广州美基公司试剂盒，生化分析采用梅里埃公司全自动生化分析仪，核酸鉴定使用Bio-Rad7500 Real-time PCR 仪，所用引物均由国家疾控中心提供。

1.3 菌株鉴定在征得调查对象同意基础上采集调查对象咽拭子，同时进行疫苗接种史等流行病学调查，采集的标本现场接种至巧克力双抗培养基，并在当地疾控中心进行培养，培养出的菌落转种至哥伦比亚血平板进一步通过生化鉴定和血清拨片凝集实验进行鉴定。

1.4 核酸提取和PCR 鉴定将采集到接种对象的咽拭子标本洗脱后提取核酸，根据ctrA 基因鉴定Nm 种属，阳性标本进行A、B、C、X、Y、W 常见血清群的real-time PCR 检测［9-10］。见表1。

1.5 统计学方法监测数据通过Excel 软件进行录入和整理，采用SPSS 17.0 软件进行数据统计和分析。不同地区、年龄、性别人群带菌情况比较采用χ2检验，不同年龄人群带菌情况比较采用秩和检验，不同人群带菌情况影响因素采用多分类Logistic回归分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细菌检出率对1 539 例调查对象咽拭子进行Nm 培养，阳性标本46 例（2.99%）。延安、西安、宝鸡和安康市阳性率分别为2.30%、2.45%、3.14%、4.29%。经玻片血清凝集反应鉴定，在46份阳性菌株中，A 群1 株，占2.17%；B 群11 株，占23.91%；C 群5 株，占10.87%；不可分群29 株，占63.04%。见表2。

2.2 核酸鉴定带菌率采用Real-time PCR 对咽拭子洗脱液进行核酸检测，结果显示1 539 例健康人群中Nm 核酸阳性110 例，阳性率为7.15%。阳性标本中A 群1 株（0.91%），B 群19 株（17.27%），C群16 株（14.55%），不可分群74 株（67.27%）。四市健康人群Nm 核酸阳性率安康市最高（10.71%），其次分别为延安市（6.13%）、西安市（8.25%）和宝鸡市（4.50%），分地区分析差异具有统计学意义（χ2= 11.88，P＜0.01）。四城市Nm 核酸菌群分年龄构成中15 ～24 岁组最高（16.36%），0 ～2 岁组最低（4.03%），差异有统计学意义（χ2= 1 200.08，P＜0.01）。见表3。

经多分类Logistic 回归分析，影响Nm 带菌情况的的危险因素有年龄（15 ～24 岁）、性别和所在地区（安康市和延安市）。其中，A 群危险因素包括年龄（＞15 岁，P＜0.05）、女性和西安地区（P＜0.05）。B 群、C 群危险因素主要为安康地区和延安地区。未分组菌型的危险因素为15～24 岁年龄和宝鸡以及安康地区。见表4。

表1 脑膜炎奈瑟菌血清型分群Real-time PCR 引物Tab.1 Serotype grouping real time PCR primers of Neisseria meningitidis

表2 陕西省不同地区健康人群脑膜炎奈瑟菌带菌情况Tab.2 Neisseria meningitidis infection in healthy population from different areas of Shaanxi province

3 讨论

陕西省自1950年进行流脑疫情的传染病报告以来，曾于1957、1967、1977、1985年发生过4 次流脑大流行，1992年以后发病率一直保持在1/10 万以下，再无暴发疫情。2004年陕西省将流脑A 群疫苗接种纳入计划免疫，对适龄儿童实施免费接种，通过小年龄组持续高覆盖的疫苗接种，流脑疾病流行得到明显控制，但同时Nm 主要致病菌株和健康人群携带Nm 血清型也发生了很大变化，为更好地了解陕西省健康人群Nm 带菌状况，本研究选取4 个地市开展健康人群Nm 带菌状况调查，调查结果Nm培养阳性率2.99%，高于河北省调查带菌率1.03%［11］，低于江苏省2015年带菌率10.07%［12］，整体处于较低水平。Real-time PCR 核酸检测结果Nm 阳性率为7.15%，其中细菌培养阳性者核酸检测均为阳性，Real-time PCR 相较于细菌培养敏感度更高，且可降低抗菌素使用的干扰［13-14］，具有更高的检出率。

本次调查的110 例Nm 核酸阳性者中，不可分群血清型最多（67.27%），其次为B 群（17.27%）和C群（14.55%）。历史上，中国以A 群Nm 引起的流脑为主［15］，B 群、C 群只引起散发病例。但随着A 群流脑多糖疫苗和A+C 群流脑多糖疫苗纳入儿童计划免疫后高覆盖率使用，Nm 流行的优势血清群正在发生变迁，我国2006-2014年流脑实验室确诊病例监测显示以C 群（44.81%）最多，其次为A 群（26.08%）和B 群（15.19%）。2015-2017年监测结果则以B 群（35.81%）为主，其次为C 群（18.24%）和A 群（6.76%），与我省监测结果基本一致。研究显示B 群Nm 引起的流脑病例比例正在显著增加，近年来已经成为病例最多的血清型［16-18］。本次调

查阳性菌株不可分群最多，传统研究认为不可分型Nm 多为健康人群携带，较少致病［19］，但国内已有不可分群菌株感染引起的脑膜炎病例的报道［20］，提示不可分群Nm 监测同样不可忽视。

表3 基于PCR 核酸检测陕西省健康人群Nm 带菌情况Tab.3 Detection of Neisseria meningitidis carrier in healthy population of Shaanxi province based on PCR

表4 陕西省健康人群Nm 带菌情况多分类Logistic 回归影响因素分析Tab.4 Analysis of influencing factors of multi classification logistic regression for Neisseria meningitidis carrier in healthy population of Shaanxi province

本次监测分地区Nm 带菌率安康市最高，其次为延安市，可能与当地气候条件及疫苗接种情况有关，具体原因有待进一步探究，提示应更加关注两地流脑防控工作。分年龄组Nm 带菌率先升高后降低再升高，分析原因，0 ～5 岁组儿童活动范围局限且接种疫苗时间不长，带菌率最低，6 ～14 岁因疫苗抗体水平逐渐下降并开始学校集体生活，带菌率出现升高趋势，15 ～24 岁组带菌率最高，25 ～44 岁组带菌率较低考虑与我国流脑大流行人群自然感染有关，≥45 岁组带菌率升高可能与该年龄段人群免疫力下降有关［21］。陕西省Nm 带菌年龄分布特征与河北省调查结果基本一致［12］。

健康人群Nm 带菌情况与流脑发病趋势相关明显，长期监测健康人群Nm 带菌率对于预测我省流脑发病及菌群变迁的提示作用意义重大，建议持续扩大范围开展各地区健康人群Nm 带菌率，以便根据Nm 分布特征及菌群变迁趋势及时调整流脑防控措施。