LncRNA SNHG11在结直肠癌患者血清中的表达及临床意义

陶绍能 王莹莹 杨军 程光华 戴云海 吕坤

皖南医学院第一附属医院弋矶山医院1核医学科，2中心实验室（安徽芜湖241000）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是最常见 的癌症之一，其病死率居世界男性和女性恶性肿瘤的第三位［1］。报告表明，CRC 患者的5年相对生存率从90%以上（早期患者）到略＞10%（第四阶段患者）不等［2］。因此，筛选早期CRC 生物标志物对于预防和正确管理疾病进展和控制CRC 诱导的病死率至关重要［3］。近年来，无创生物标志物的研究已成为一个热点。然而，常用的血清肿瘤生物标志物CEA 和CA19-9，对早期CRC 诊断具有有限的敏感性和特异性，并产生有争议的预后价值［4-5］。因此迫切需要具有高灵敏度和特异性的新型无创分子诊断生物标志物。

长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）包含长度超过200 nt RNA，蛋白质编码能力有限或者无蛋白质编码能力的一类转录物。循环中的LncRNAs 已被证实在结直肠癌中具有诊断价值［6-8］，这表明LncRNA 作为肿瘤生物标志物具有巨大的潜力。SNHG11（small nucleolar RNA host gene 11）位于人类染色体20q11.23，长4 268 bp，属于LncRNA［9］。现有对LncRNA 研究的文献资料大部分是对患者组织样本的，对外周血中LncRNA的研究甚少。本研究拟通过检测结直肠癌患者血清中SNHG11 的表达水平，并进一步分析其与临床病理资料之间的关系，从而探索SNHG11 作为结直肠癌的一种生物标记物的可能性及其临床应用。

1 资料与方法

1.1 一般资料我院住院的结直肠癌患者（CRC组）70 例，平均年龄（62.2±11.6）岁。其中男51 例，平均年龄（63.6 ± 11.1）岁；女19 例，平均年龄（58.4± 12.3）岁。结直肠良性疾病（CBD 组）35 例，平均年龄（55.7 ± 11.2）岁。其中男23 例，平均年龄（54.0±10.6）岁；女12 例，平均年龄（56.4±9.7）岁。所有病例均有病理诊断，其术前未接受任何放化疗治疗。同时选取接受体检的健康人（NC 组）35 例作为对照组，平均年龄（59.9±12.6）岁。其中男23 例，平均年龄（63.9 ± 11.8）岁；女12 例，平均年龄（52.4±10.8）岁。

1.2 主要仪器及试剂Trizol 试剂（北京天根生化科技有限公司）；RNA 提取试剂盒、RNA 逆转录试剂盒、RNA 荧光定量试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；LncRNA SNHG11 与内参基因β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成。主要仪器包括台式低温高速离心机（美国Thermo 公司），RNA 浓度检测仪（美国Thermo 公司），荧光定量PCR 仪（美国Bio-Rad 公司）。

1.3 样本收集清晨空腹抽取静脉血5 mL，4 h 内在4 ℃，16 000 ×g，离心10 min 取上清液至无RNA酶的EP 管中；为更加彻底去除血清中杂质成分对试验结果的影响，4 ℃，1 600×g再离心10 min。将分离的血清置于无RNA 酶的EP 管中，-80 ℃冰箱中保存备用。

1.4 总RNA 提取将分离的血清置于冰上融化解冻后，严格按照试剂说明书提取总RNA。将提取的总RNA 用分光光度仪测定其浓度和纯度。选取A260/A280在1.8～2.0 的样品进行反转录，反应程序：25 ℃10 min，42 ℃45 min，70 ℃15 min。cDNA样本置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.5 qRT-PCR 检测LncRNASNHG11 的表达以逆转录获得的cDNA 为模板，采用qRT-PCR 进行扩增反应。SNHG11 引物序列：上游5′-GTGTGAGGATGTCCCTGGAT-3′，下游5′-CCCCAAACAATCATGAGGAG-3′；内参β-actin 引物序列：上游5′-AAGCCACCCCACTTCTCTCTAA-3′，下游：5′-AATGCTATCACCTCCCCTGTGT-3′。预变性95 ℃10 min；PCR反应以95 ℃15 s、58 ℃30 s、72 ℃10 s 为一个循环，进行45 个循环：溶解曲线分析95 ℃30 s、70 ℃1 s、95 ℃1 s。采用ΔCt 法计算各目的基因的相对表达值，作为评估目的基因在疾病组和健康对照组中表达差异的指标。ΔCt=CtSNHG11-Ctβ-actin，ROC 曲线采用2-ΔΔCt。

1.6 统计学方法采用SPSS 23.0软件进行统计学处理，GraphPad Prism 5.0 软件进行绘图。数据采用非参数检验，两组之间比较采用Mann-WhineyU检验，三组间比较采用Kruskal-WallisH检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清LncRNA SNHG11 在良恶性结直肠疾病中的表达与健康对照组比较，SNHG11 在结直肠癌中明显升高，差异有统计学意义（Z=-5.583，P＜0.01），而与结直肠良性疾病差异无统计学意义（Z=-1.100，P= 0.272）。结直肠良恶性疾病差异有统计学意义（Z=-6.613，P＜0.01），见图1A。SNHG11 在TNMⅠ/Ⅱ期中的表达较健康对照组明显升高（Z=-4.667，P＜0.01），但是在TNMⅠ/Ⅱ期与TNM Ⅲ/Ⅳ期之间差异无统计学意义（Z=-1.233，P=0.218），见图1B。

2.2 结直肠癌患者血清SNHG11 水平与临床病理参数的关系结直肠癌患者血清SNHG11 与结直肠癌患者的年龄、性别、TNM 分期、病理类型、淋巴结转移及远处转移等临床病理参数之间无明显相关性（P＞0.05）。见表1。

2.3 血清SNHG11 对结直肠癌诊断价值的分析见图2。血清SNHG11 诊断结直肠癌的AUC 优于传统的肿瘤标志物CEA、CA199（0.866、0.714、0.638），诊断敏感性明显高于CEA 和CA199，分别为0.786、0.457、0.343，但是特异性略低于CEA、CA199，分别为0.871、0.929、0.929。联合CEA 检测可略提高检测效能（AUC = 0.895），提高检测的灵敏度。见表2。

图1 SNHG11 在结直肠癌患者血清中的表达Fig.1 Expressionlevelof SNHG 11 in serum of patients with colorectal cancer

图2 血清SNHG11 与CEA、CA199 诊断结直肠癌ROC 曲线图Fig.2 ROC curve of serum SNHG11，CEA and CA199 in the diagnosis of colorectal cancer

表1 结直肠癌患者血清SNHG11 水平与临床病理参数的关系Tab.1 The relationship between serum SNHG11 level and clinicopathological parameters in patients with colorectal cancer ±s

表1 结直肠癌患者血清SNHG11 水平与临床病理参数的关系Tab.1 The relationship between serum SNHG11 level and clinicopathological parameters in patients with colorectal cancer ±s

病理参数年龄≥60 岁＜60 岁性别男 女TNM 分期Ⅰ/Ⅱ期Ⅲ/Ⅳ期病理类型溃疡型隆起型浸润型淋巴结转移有 无远处转移有 无例数40 30 51 19 32 38 54 13 3 33 37 11 59 SNHG11（ΔCt）3.623±0.956 3.860±1.251 3.647±1.053 3.932±1.189 3.484±1.089 3.926±1.063 3.602±1.091 4.192±1.103 3.900±0.557 3.997±1.109 3.481±1.027 3.756±1.162 3.555±0.570 Z/H 值-0.570-0.767-1.233 2.439-1.619-0.525 P 值0.569 0.443 0.218 0.295 0.105 0.600

表2 SNHG11 在结直肠癌中的诊断效能分析Tab.2 Analysis of diagnostic efficacy ofSNHG11 in colorectal cancer

3 讨论

LncRNA 是一种调节性RNA，在众多细胞途径中起着关键作用。全基因组分析发现许多LncRNA在恶性组织和正常组织之间有差异表达［10-11］，武雪亮等［12］研究发现LncRNA HOTAIR mRNA 在结直肠癌组织中的表达明显较正常结直肠组织高，与临床病理特征及预后关系密切。此外，肿瘤衍生的LncRNA 可以在多种生物体液中检测并保持稳定［10，13］，这些表明LncRNA 有可能作为癌症诊断和预后的无创生物标记物。

SNHGs 在各种肿瘤中得到了广泛的研究，例如，SNHG 6 通过miR-101-3p 和Wnt/β-catenin 信号通路促进结直肠癌的进展［14］。SNHG8 通过对miR-149-5p 的应答促进肝癌的发生和转移，并预测肝癌的复发［15］。SNHG1 通过miR-448/IDO 调节Treg细胞分化，影响乳腺癌的免疫逃逸［16］。SNHG2 被称为GAS5，是一种肿瘤抑制基因，GAS5 的下调与CRC 的恶性程度及淋巴结转移密切相关［17］。SNHG14 在乳腺癌中高表达并通过miR-144/CEP55信号轴促进乳腺癌细胞的增殖和迁移［18］。SNHG11位于人类染色体20q11.23，属于LncRNA。但是SNHG11 在结直肠疾病中的报道较为罕见。本研究结果显示，血清SNHG11 不但在CRC 患者与健康对照相比明显升高，而且与结直肠良性疾病相比也升高，这在临床上将有利于根据SNHG11 血清水平来判断结直肠疾病的严重程度，从而采取相应的治疗措施改善结直肠疾病患者的预后。同时，本研究发现CRC 患者在TNM Ⅰ/Ⅱ期时其SNHG11 血清水平较健康对照升高，说明其在早期诊断方面可能具有一定的价值。但是，其在CRC患者中的表达水平并不随肿瘤的发展而升高，其具体机制不明，有待于进一步的研究。

有文献报道［19］SNHG11 在组织中的表达水平与结直肠癌分期、淋巴结转移、远处转移及TNM分期相关。最近，XU 等［20］报道血浆SNHG11 在CRC 中可作为早期诊断和预后的一个新的生物标志物。但是在本研究中血清SNHG11 与临床相关病理参数之间并无相关性，这可能与患者标本来源不同、肿瘤异质性、研究病例的多少等多种因素有关。

通过ROC 曲线分析发现，血清SNHG11 在结直肠癌中的诊断效能明显优于传统肿瘤标志物CEA、CA199（AUC = 0.866、0.714、0.638），其灵敏度可达78.6%，特异性可达87.1%，联合CEA 可提高其诊断效能（AUC = 0.895），联合CA199 对诊断效能提高不显著。但是本研究未能观察治疗前后血清SNHG11 在血清中的变化，无法判断其是否可作为治疗监测指标，后续将扩大病例进一步研究其在早期诊断及治疗监测方面的作用。

总之，SNHG11 在结直肠癌患者血清中异常高表达，可作为结直肠癌新的诊断循环分子标志物，与CEA 联合诊断可提高结直肠癌的诊断效能。