缝隙连接蛋白43基因多态性与大动脉粥样硬化型脑梗死的相关性研究

李俊彦 何来鹏 陆冰 叶剑 李友

广东医科大学附属医院老年医学中心（广东湛江524001）

缺血性脑梗死约占脑卒中70% ～80%，其中TOAST 分型中的大动脉粥样硬化型脑梗死（atherosclerotic cerebral infarction，ACI）是缺血性脑梗死常见类型［1-2］。ACI 最根本的病因是动脉粥样硬化，而各细胞之间缝隙连接的直接通讯失调是引起动脉粥样硬化的重要环节［3］。

许多研究表明，缝隙连接蛋白43（connexin 43，Cx43）分布于人体的各种细胞与组织中，尤其是中枢神经系统，其参与内皮细胞损伤后修复、内环境稳态及细胞新陈代谢等病理生理过程，特别与脑缺血密切相关［4-7］。近年来，一些动物研究发现Cx43 的异常表达与脑缺血再灌注损伤有关［8-10］。此外，CHEN 等［11］研究发现Cx43 的异常表达通过影响肿瘤坏死因子-α、白介素-6 及干扰素-γ等炎症因子的表达，参与神经炎症和大动脉粥样硬化的病理生理过程，进而导致急性缺血性脑梗死的发生。加拿大学者FREITAS-ANDRADE 等［12］报道了急性缺血性脑梗死小鼠脑核心坏死区的Cx43表达水平于缺血3 h 后逐渐降低，提示过表达Cx43可作为治疗早期急性缺血性脑梗死的潜在机制。

近年来，一些研究发现Cx43 基因多态性与心房纤颤、房间隔缺损及法洛四联症等心脏相关疾病易感性有关［13-15］。此外，GU 等［15］报道了Cx43 基因启动子区rs2071166 位点多态性可影响其启动子转录活性，进而引起Cx43 基因mRNA 表达异常。迄今为止，从分子遗传学角度研究Cx43 基因多态性与ACI 易感性的关系尚未见国内外研究报道。基于此，本研究以广东汉族人群为研究对象，分析Cx43 基因启动子区rs2071166 多态性位点与ACI 易感性的关系，并进一步研究ACI 患者外周血Cx43基因mRNA 表达水平的变化以及rs2071166 位点多态性对Cx43 基因mRNA 表达水平的影响，为进一步阐明Cx43 基因多态性与ACI 易感性的关系提供强有力的分子流行病学依据，为ACI 的诊治打下理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2015年1月至2018年12月在广东医科大学附属医院老年医学中心住院的初发的ACI 患者（病例组）300 例，所有患者均经头部磁共振检查确诊，根据TOAST 分型归类为ACI，并剔除既往有其他类型的脑梗死或脑出血病史患者。对照组来源于我院健康体检中心同期进行体检的健康者300 例。所有研究对象均为广东汉族人群，并且相互之间无血缘关系。本次研究已通过广东医科大学附属医院伦理委员会审核，所有研究对象均签署知情同意书。两组的性别、年龄分别比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 病例组和对照组的临床资料比较Tab.1 The comparison of clinical data between the case group and control group ±s

表1 病例组和对照组的临床资料比较Tab.1 The comparison of clinical data between the case group and control group ±s

注：CHOL，总胆固醇；TG，甘油三脂；HDL，高密度脂蛋白；LDL，低密度脂蛋白

临床资料年龄（岁）性别（男/女，例）吸烟史［例（%）］饮酒史［例（%）］高血压病史［例（%）］2型糖尿病史［例（%）］空腹血糖（mmol/L）CHOL（mmol/L）TG（mmol/L）HDL（mmol/L）LDL（mmol/L）病例组（n=300）68.15±10.35 187/113 185（61.7）116（38.7）181（60.3）108（36.0）6.78±1.35 5.14±1.24 2.07±0.99 1.35±0.34 3.12±1.13对照组（n=300）67.67±10.14 174/126 92（30.7）94（31.3）85（28.3）25（8.3）5.52±1.19 4.89±1.16 1.85±0.86 1.48±0.42 2.82±1.02 t/χ2值0.574 1.175 58.001 3.546 62.239 66.549 12.13 2.550 2.906 4.167 3.413 P值0.566 0.278＜0.001 0.060＜0.001＜0.001＜0.001 0.011 0.004＜0.001＜0.001

1.2 基因型检测抽取所有研究对象空腹外周静脉血2 mL，收集于枸橼酸钠抗凝管，采用QIAamp DNA 提取试剂盒（QIAGEN 公司）抽提基因组DNA。运用SNaPshot 技术［16］（Applied Biosystems，USA）分别对300 例病例组和300 例对照组的Cx43基因启动子区rs2071166 多态性位点进行基因型检测，主要操作过程包括：PCR 反应、单碱基延伸反应和基因多态性位点序列测定，PCR 上游引物序列：5′-ATCTCCACCATTCCCTTTGTTA-3′；下游引物序列：5′-TGGGGAAGCATATAACCAGTTC-3′。

1.3 外周血单个核细胞总RNA 提取和荧光定量PCR随机选取30 例对照组和30 例病例组，按照密度梯度离心法和TRIzol 法分别提取两组外周血单个核细胞和单个核细胞总RNA。根据cDNA 反转录试剂盒（Thermal Scientificx）的操作步骤将单个核细胞总RNA 反转录为cDNA。采用荧光定量PCR 方法测定两组外周血单个核细胞Cx43 mRNA相对表达量。Cx43 基因上游引物序列：5′-CAGCTTGTACCCAGGAGGAG-3′，Cx43 基因下游引物序列：5′-TGTCCCTGGCCTTGAATATC-3′；GAPDH 基因上游引物序列：5′-CACCAGGTGGTCTCCTCTGAC-3′，GAPDH 基 因 下游 引 物序 列：5′-GGTGGTCCAGGGGTCTTACTC-3′。每个cDNA 样本重复检测3 次荧光定量PCR，运用2-ΔΔCt值计算Cx43 mRNA相对表达量。

1.4 统计学方法运用直接计数法统计两组等位基因和基因型频率；采用χ2检验方法统计两组的等位基因和基因型频率分布比较以及哈迪-温伯格定律（Hardy-Weinburg equilibrium，HWE）检测；采用均数±标准差来表示计量资料，两组间的均数比较采用t检验；采用Logistic 回归分析校正两组临床资料后进一步分析基因多态性与ACI 易感性的关系。本次研究数据统计分析运用SPSS 19.0 软件，均为双侧检验，P＜0.05 代表组间差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料病例组HDL 低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。病例组CHOL、TG、LDL、空腹血糖、2 型糖尿病患病率、高血压患病率及吸烟率明显高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

2.2 两组Cx43 基因rs2071166 多态性位点的等位基因和基因型频率分布病例组和对照组的Cx43基因rs2071166 多态性位点基因型频率分布均符合HWE（P= 0.134、0.415）。病例组Cx43 基因rs2071166 多态性位点的AA、AC 和CC 基因型频率分别是56.7 %、35.0 %和8.3 %，对照组分别是67.7%、28.3%和4.0%，两组比较差异有统计学意义（AAvs.ACvs.CC：P= 0.008；显性模型CC + ACvs.AA：P=0.005；隐性模型CCvs.AC+AA：P=0.027）；病例组Cx43 基因rs2071166 多态性位点C 等位基因频率明显高于对照组（25.8 %vs.18.2 %，OR=1.569，95%CI：1.190 ～2.069，P=0.001，见表2）。

表2 两组Cx43 基因rs2071166 位点基因型和等位基因频率分布比较Tab.2 The comparison of the genotype and allele frequencies of the SNP rs2071166 between the case group and control group例（%）

2.3 Cx43 mRNA 相对表达量的比较和rs2071166多态性位点对Cx43 mRNA 相对表达量的影响随机选取的病例组30 例的外周血单个核细胞Cx43 mRNA 相对表达量明显低于对照组30 例［（0.32 ±0.07）vs.（0.67±0.12）］，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。对对照组30 例rs2071166 多态性位点的基因型与Cx43 mRNA 相对表达量的关系分析提示CC + AC 基因型（C 等位基因携带者）的外周血单个核细胞Cx43 mRNA 相对表达量明显低于AA 基因型［（0.39±0.09）vs.（0.94±0.15），P＜0.05］，见图2。

图1 病例组和对照组外周血单个核细胞Cx43 mRNA 相对表达量比较Fig.1 The comparison of the Cx43 mRNA relative expression in the mononuclear cells between the case group and control group

图2 Cx43 基因rs2071166 位点不同基因型Cx43 mRNA 相对表达量比较Fig.2 The comparison of the Cx43 mRNA relative expression between the different genotypes of the SNP rs2071166 in the Cx43 gene

3 讨论

脑动脉粥样硬化是引起ACI 的最常见病因，其中动脉粥样硬化具体的发病机制尚未完全明确［17-18］。近年来，大量研究表明缝隙连接与动脉粥样硬化之间存在非常密切的关联。缝隙连接广泛分布于哺乳类动物的各种细胞、组织和器官（红细胞和骨骼肌除外），与血管平滑肌细胞的增生和血管内皮细胞损伤、修复密切相关，参与动脉粥样硬化的发病机制［19-21］。

缝隙连接蛋白目前在哺乳类动物中发现至少有20 余种，并根据各自的分子量来命名。Cx43 编码分子量为43 kDa 的多肽，包含有387 个氨基酸。LERNER 等［22］研究表明Cx43 的异常表达和动脉粥样硬化、缺血性心脏病密切相关。国内学者刘坤等［23］研究发现大鼠大脑中星形胶质细胞Cx43 的表达参与急性脑缺血的病理过程。人Cx43 基因位于6 号染色体长臂2 区，主要由1 个内含子和2 个外显子组成。近年来，WANG 等［24］研究发现Cx43 基因多态性与汉族人群高血压病相关。洪涛等［25］报道了Cx43 基因S368 位点与脑血管痉挛有关。

本研究发现ACI 患者HDL 低于对照组，CHOL、TG、LDL、空腹血糖、2 型糖尿病患病率、高血压患病率及吸烟率明显高于对照组，差异均有统计学意义，这提示血脂异常、糖尿病、高血压病及吸烟与ACI 的发病密切相关。ACI 患者rs2071166 位点的基因型频率分布与对照组相比，差异有统计学意义，其中ACI 患者CC+AC 基因型（C 等位基因携带者）明显高于对照组（OR=1.600，95%CI：1.147 ～2.232，P=0.005）。Logistic 回归分析校正年龄、性别、吸烟史、饮酒史、高血压病史、2 型糖尿病史、空腹血糖、CHOL、TG、HDL 和LDL等多个混杂因素后，结果依然显示rs2071166 位点显性模型和隐性模型均与ACI 发病风险有关（P= 0.017、0.041）。此外，ACI 患者C 等位基因明显高于对照组（OR=1.569，95%CI：1.190 ～2.069，P= 0.001）。这提示rs2071166 位点C 等位基因可能是ACI 易感性的危险因素。同时，本研究发现ACI 患者Cx43 mRNA 相对表达量明显低于对照组（P＜0.05），并且对照组C 等位基因携带者的Cx43 mRNA 相对表达量明显低于AA 基因型（P＜0.05）。基于此，本文推测rs2071166 多态性位点的C 等位基因可能降低Cx43 基因的启动子活性，从而导致Cx43 mRNA 的表达下调。GU 等［15］通过斑马鱼研究发现携带rs2071166 位点CC 基因型的个体其Cx43 基因启动子活性明显低于AA + AC 基因型，这与我们的推测相一致。

本研究从分子遗传学角度研究Cx43 基因多态性与ACI 易感性的关系，并发现rs2071166 位点C 等位基因可能是ACI 易感性的危险因素。但是，本次研究仍存在以下几点不足。首先，本研究病例-对照研究的样本量相对少。其次，本研究只分析了Cx43 基因启动子区rs2071166 位点与ACI 易感性的相关性。基于此，后续会加大样本量，并选取Cx43 基因其余多态位点进一步分析其与ACI 的关系。此外，针对不同时期、不同TOAST 分型的缺血性脑梗死分析其与Cx43 基因表达的相关性，会作并进一步对启动子区多态性位点进行功能相关性研究。

综上所述，Cx43 基因启动子区rs2071166 多态性位点与ACI 易感性密切相关，其中C 等位基因可能通过降低启动子转录活性导致Cx43 基因表达下调，进而参与ACI 的发病。