无蔗糖山楂果丹皮对小鼠便秘的预防作用

李 涛,徐力涵,刘 军,闫巧娟,江正强,*

(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;2.中国农业大学工学院,北京 100083)

山楂(CrataeguspinnatifidaBunge)为蔷薇科山楂属植物,含有丰富的营养和生理活性成分,作为食品原料在食品工业中应用广泛,其中以果丹皮为代表的山楂蜜饯类食品尤其受广大消费者的欢迎[1-4]。但果丹皮的白砂糖(蔗糖)含量高达50%以上,极易被肠道消化从而引发肥胖、高血压、糖尿病、龋齿等一系列健康风险[5]。高糖含量的果丹皮令肥胖和糖尿病患者等人群望而却步,严重限制了包括果丹皮在内的高糖食品的消费,不利于行业的可持续发展[6]。因此,高糖食品中蔗糖替代已成为新兴的研究热点,其中主要的蔗糖替代物有功能性糖及糖醇[7]。

目前,无蔗糖山楂果丹皮的制备仅局限在利用普通无糖类甜味剂替代蔗糖或与甜度较大的食品原料复配来实现无糖化。李世安等[8]将山楂与罗田甜柿复合制备不用添加糖浆即可达到食用甜度的无蔗糖山楂果丹皮;冯洪新等[9]使用麦芽糖醇或木糖醇替代蔗糖制作了无糖的山楂果丹皮,但未对其制备的果丹皮进行功能性研究。功能食品的应用已成为行业可持续发展的关键,目前已有一些关于制备功能食品改善便秘的相关报道。动物实验表明,功能性低聚糖及糖醇类物质可改变肠道菌群结构,维持肠道结构的完整性,从而调节人体肠道的微生态平衡,起到润肠通便的作用[10-11]。研究发现低聚果糖、低聚半乳糖和低聚异麦芽糖的摄入可提高便秘小鼠粪便中水分含量,同时可促进肠道益生菌增殖并产生大量的短链脂肪酸(SCFAs)刺激肠道蠕动,增加粪便的湿润度[12]。临床医学证明低聚木糖具有润肠通便的功能[13]。同时,研究发现蔗糖替代物的复合效果较单一替代物预防便秘的效果更明显[14]。金鑫等[15]利用水苏糖及甜菊糖苷等为原料制备了一种功能食品,能够缩短以地芬诺酯诱导的便秘小鼠的排便时间,同时提高了其小肠推进率。综上研究发现目前尚无含低聚木糖的无蔗糖山楂果丹皮的制备及改善便秘的相关报道。

本研究旨在以功能性低聚糖及糖醇替代传统果丹皮中的蔗糖制作无蔗糖山楂果丹皮,通过感官评价、质构、色差和理化指标测定等评价无蔗糖山楂果丹皮的品质。以盐酸地芬诺酯药物诱导昆明小鼠便秘模型,研究无蔗糖山楂果丹皮预防便秘的功效,并初步探讨其机理,为无糖功能食品的开发提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

4周龄雌性SPF级昆明小鼠(27±1) g 北京维通利华实验动物有限公司;普通维持饲料(含碳水化合物50%、脂肪10%、蛋白质20%) 北京科奥协力饲料有限公司;山楂果 河北省兴隆县;低聚木糖(95%纯度) 山东龙力生物科技股份有限公司;木糖醇(96%纯度)、蔗糖(98%纯度) 上海万佳食品有限公司;盐酸地芬诺酯 北京利华开顺贸易有限公司;比沙可啶、伊红、苏木素 美国Sigma试剂公司;活性炭、甲醛、盐酸、冰醋酸、氯化钠 国药集团试剂有限公司。

华卫德朗DR-200BS酶标分析仪 无锡华卫德朗仪器有限公司;安捷伦1260型高效液相色谱仪 美国Agilent公司;SES-1Y型单层电烤箱 江苏三麦食品机械有限公司;12PLS507A型微电脑式电压力锅 美的集团;NS800分光测色仪 深圳三恩时科技有限公司;TMS-PRO质构仪 美国FTC公司。

1.2 实验方法

1.2.1 无蔗糖山楂果丹皮的制备方法 参照我国北方传统的山楂果丹皮制作工艺进行[16]。100 g洗净的山楂果中加入70 g相应蔗糖替代物及60 g水,以蔗糖山楂果丹皮、木糖醇山楂果丹皮和低聚木糖山楂果丹皮作为对照,配方如表1所示。将其放入高压锅中,蒸煮20 min,用刮铲将蒸煮结束的物料均匀捣碎并混合均匀,并通过滤网得到匀浆。将匀浆缓慢倒在锡纸上,确定锡纸与刮片的高度为4 mm,缓慢拖动锡纸得到铺匀的匀浆。将锡纸连同匀浆放入烘箱中,60 ℃烘烤8 h。

表1 山楂果丹皮的配方Table 1 The formula of hawthorn rolls

1.2.2 选取最佳山楂果丹皮蔗糖替代物 选取厚度均匀、表面完整的山楂果丹皮,通过感官评价、质构、色差和理化指标来测定。

1.2.2.1 山楂果丹皮的感官评价 采用评分法对制备的山楂果丹皮进行感官评价[17]。邀请10名评价员(5男5女)对山楂果丹皮的口味、色泽、口感、质地等进行评价打分,感官评价标准如表2所示:

表2 果丹皮的感官评价标准Table 2 The sensory evaluation standards of hawthorn rolls

1.2.2.2 山楂果丹皮的色差、质构测定 采用色差仪采集山楂果丹皮的色差数据[18]。用黑白板校准色差仪,设定测量模式为L/a/b色彩模式。将探头紧贴于果丹皮表面,采集果丹皮色彩参数(L、a、b),并以蔗糖果丹皮的色彩参数(L0、a0、b0)为基准计算色差(ΔE)。

取每块山楂果丹皮中间的平整均匀部分(2 cm×2 cm),采用质构仪进行果丹皮的质构评价。将质构仪调至质地剖面分析(TPA)测定模式中的硬度模式,采用P/36R圆柱型探头,设定探头前进速度为30 mm/min,压缩次数为2次,引发力为0.5 N,形变量测定为30%,探头复始高度为20 mm[19]。

1.2.2.3 山楂果丹皮的理化性质测定 分别按照GB/T 31318-2014《蜜饯 山楂制品》指定的GB5 009.3《食品中水分的测定》、GB 5009.4《食品中灰分的测定》及GB/T 10782-2006《蜜饯通则》中的方法测定果丹皮的水分、灰分及总糖含量。

1.2.3 动物便秘模型的建立及给药

1.2.3.1 小鼠便秘建模 采用30 mg/kg·bw/d剂量的盐酸地芬诺酯灌胃建立小鼠便秘模型[20]。

1.2.3.2 动物实验分组 昆明小鼠的饲养温度保持在(25±5) ℃,相对湿度保持在50%±10%,灯光始终保持12 h明暗交替状态(7:00～19:00为白昼时间、19:00～次日7:00为黑夜时间)。所有小鼠先进行7 d的适应性喂养,随后将实验动物按体重随机分为9组,分别为阴性对照组、模型组、比沙可啶组(0.1 g/kg·bw/d)、蔗糖果丹皮组(6 g/kg·bw/d)、木糖醇果丹皮组(6 g/kg·bw/d)、低聚木糖果丹皮组(6 g/kg·bw/d)、50%木糖醇+50%低聚木糖果丹皮低剂量组(3 g/kg·bw/d)、50%木糖醇+50%低聚木糖果丹皮中剂量组(6 g/kg·bw/d)和50%木糖醇+50%低聚木糖果丹皮高剂量组(9 g/kg·bw/d)。使用生理盐水溶解比沙可啶及山楂果丹皮,配制成对应浓度溶液后进行灌胃,每组10只。

前14 d每天上午8:00给小鼠灌胃。阴性对照组和模型组以10 mL/kg·bw/d灌胃生理盐水;比沙可啶组灌胃0.1 g/kg·bw/d比沙可啶;样品组以相对应山楂果丹皮匀浆液灌胃各组。在第15和16 d,各山楂果丹皮样品组和比沙可啶组先灌胃相应样品,然后除阴性对照组灌胃生理盐水外其他各组均以30 mg/kg·bw/d灌胃盐酸地芬诺酯建模。建模结束后进行相关指标的测定。

1.2.4 测定指标

1.2.4.1 小鼠小肠推进率的测定 参考Xu等[21]的方法测定小肠推进率。建模结束后将每组随机取5只小鼠禁食,18 h后灌胃样品,30 min后对除阴性对照组外其余各组小鼠灌胃30 mg/kg·bw的盐酸地芬诺酯溶液,阴性对照组灌胃生理盐水。30 min后以10 mL/kg·bw的剂量将所有小鼠灌胃10%活性炭水。25 min后眼球取血、脱颈处死。解剖小鼠后剪取其上自幽门、下至回盲肠的整根小肠,将整条小肠自然拉成直线。量取小肠的总长度(L1),此即为“小肠全长”;量取自幽门至活性炭推进前沿的小肠长度(L2),此即为“活性炭推进距离”,按公式1计算小肠推进率。

式(1)

1.2.4.2 小鼠的首粒黑便排出时间及6 h排出黑便的粒数、湿重的测定 建模结束后将每组剩余5只小鼠禁食,18 h后灌胃样品。30 min后除阴性对照组外将其余各组小鼠灌胃30 mg/kg·bw的盐酸地芬诺酯,阴性对照组灌胃生理盐水。30 min后以10 mL/kg·bw的剂量将所有小鼠灌胃10%活性炭水并立即将小鼠分成单笼饲养,开始准确计时,并饲喂普通维持饲料及水。连续观察6 h,记录每只小鼠首粒黑便排出时间。称量小鼠6 h排出黑便的粒数及湿重。

1.2.4.3 小鼠血清中胃动素及P物质含量的测定 将测定小肠推进率的小鼠进行摘眼球取血,室温放置4 h,在3000 r/min,4 ℃的条件下离心10 min,取上层血清按照胃动素、P物质酶联免疫试剂盒的说明书进行含量测定。

1.2.4.4 小鼠粪便中有机酸的提取与定量检测 小鼠粪便中有机酸的提取参考王彩等[22]的方法。称取0.6 g小鼠粪便加入1.2 mL蒸馏水中,匀浆后以12000 r/min离心10 min,收集上清液。向上清液加入100 μL浓盐酸,再加入5 mL乙醚充分混匀,常温萃取20 min,以3500 r/min离心10 min。将上层有机相转移到另一管中,加入500 μL的1 mol/L的NaOH溶液,充分混匀,常温萃取20 min,以3500 r/min离心10 min。收集下层水相,加入100 μL浓盐酸,混匀,所得提取液用0.22 μm水系滤膜过滤后进行高效液相色谱(HPLC)检测。

1.3 数据分析

采用IBM SPSS statistics 23.0软件分析实验数据,所有数据均表示为mean±SD。组间数据的显著性分析采用一维方差分析(One-Way ANOVA)中的Duncan(D)多重比较进行。P<0.05表示数据具有显著差异。

2 结果与分析

2.1 选取最佳果丹蔗糖替代物

2.1.1 无蔗糖山楂果丹皮的感官评价 无蔗糖山楂果丹皮感官评价见表3。无蔗糖山楂果丹皮的口味评分、色泽评分和感官评价总分随低聚木糖添加量的增加呈下降趋势。当低聚木糖的添加量为25%或50%时,该复合果丹皮的感官评价总分与蔗糖果丹皮相比无显著差异(P>0.05),说明含25%或50%的低聚木糖与木糖醇复合制备的无蔗糖山楂果丹皮在感官品质上与蔗糖果丹皮相近,迎合大众对于传统果丹皮的感官要求。

表3 无蔗糖山楂果丹皮的感官评价Table 3 The sensory evaluation of sugar-free hawthorn rolls

2.1.2 无蔗糖山楂果丹皮的色差及质构 无蔗糖山楂果丹皮的色差见表4。在L值方面,木糖醇果丹皮和低聚木糖/木糖醇(75∶25)复合果丹皮与蔗糖果丹皮相比无显著性差异。在a值方面,木糖醇果丹皮和低聚木糖/木糖醇(50∶50)复合果丹皮与蔗糖果丹皮相比无显著差异。在b值方面,木糖醇果丹皮和低聚木糖/木糖醇(25∶75)复合果丹皮与蔗糖果丹皮相比无显著差异。ΔE表征颜色的差别,其由L/a/b拟合而成。随着低聚木糖含量的增加,果丹皮的色差(ΔE)呈现先上升后下降的趋势。当低聚木糖的添加量为25%时,果丹皮的色差与蔗糖果丹皮相比无显著差异,表明可接近蔗糖果丹皮的色泽特点。

表4 无蔗糖山楂果丹皮的色差Table 4 The chromatic aberration of sugar-free hawthorn rolls

质构特性中,硬度是衡量果丹皮品质的十分重要的指标。由表5可以看出,随着低聚木糖添加量的增加,果丹皮的硬度值呈现上升的趋势,降低了果丹皮品质。内聚性表示样品内部的粘合力,从表中看出各组果丹皮内聚性无显著性差异,表明低聚木糖的添加对果丹皮内聚性无明显影响。弹性是衡量样品去除外力后恢复到形变前条件下的高度或体积比率,由表5可以看出75%低聚木糖的添加显著增加了果丹皮弹性(P<0.05),而随着低聚木糖的添加量降低则显著降低了果丹皮弹性,100%木糖醇的添加与蔗糖果丹皮的弹性相比,没有显著性影响。胶黏性是探头受力与时间所形成的负峰面积,反映了果丹皮咀嚼时具有的黏附性。当低聚木糖的添加量不高于50%时,与蔗糖果丹皮相比胶黏性无显著性差异(P>0.05)。咀嚼性一般是固态食品的硬度、凝聚性和弹性的综合,其大小代表固态食品咀嚼成能够吞咽的状态所需要的能量。由表5可以看出,随着低聚木糖添加量的增加,果丹皮的咀嚼性呈现上升的趋势。表明低聚木糖的适量添加能改善符合果丹皮质构中的硬度、胶黏性和咀嚼性等参数,使其更接近于蔗糖果丹皮。

表5 无蔗糖山楂果丹皮的质构Table 5 The texture of sugar-free hawthorn rolls

2.1.3 无蔗糖山楂果丹皮的理化性质 本实验选取了与蔗糖果丹皮感官总分无显著差异的果丹皮按照GB/T 31318-2014《蜜饯 山楂制品》进行理化性质的测定,结果如表6所示,各组果丹皮的水分、灰分、总糖含量均符合标准[水分含量(%)≤30.0;灰分含量(%)≤1.5;总糖含量(%,以葡萄糖计)≤75.0]。其中木糖醇果丹皮、75%木糖醇与25%低聚木糖复合果丹皮和50%木糖醇与50%低聚木糖复合果丹皮的总糖含量无法用GB/T10782-2006《蜜饯通则》的斐林标定法测出总糖含量,推测原因是非还原性的木糖醇不能还原斐林试剂生成红色氧化亚铜且干扰了低聚木糖与斐林试剂的反应。因此,选取理化性质最接近于蔗糖果丹皮的木糖醇/低聚木糖(50∶50)复合果丹皮进行后期的便秘实验。

表6 无蔗糖山楂果丹皮的理化性质Table 6 The physicochemical properties of sugar-free hawthorn rolls

2.2 无蔗糖山楂果丹皮对小鼠小肠推进率的影响

无蔗糖山楂果丹皮对便秘小鼠小肠推进率的影响见表7。阴性对照组及比沙可啶组的推进率显著高于模型组(P<0.05)。各果丹皮样品组的推进率均显著高于模型组(P<0.05),其中木糖醇果丹皮组及50%木糖醇与50%低聚木糖复合果丹皮各剂量组的推进率显著高于蔗糖果丹皮组,其中改善小肠推进率效果最好的是50%木糖醇与50%低聚木糖中剂量复合果丹皮,其小肠推进率相比模型组提高了108.9%。Kwon等[23]利用低聚半乳糖和乳果糖复合物喂养洛哌丁胺诱导的便秘小鼠,结果表明摄食低聚糖复合物后小鼠的小肠推进率仅比模型组提高33.3%。低聚木糖具有显著的益生功效,能高效选择性地增殖双歧杆菌,加速小肠蠕动[24]。

表7 无蔗糖山楂果丹皮对便秘小鼠小肠推进率的影响Table 7 Effects of sugar-free hawthorn rolls on small intestinal propulsion rate in mice model of constipation

2.5 无蔗糖山楂果丹皮对小鼠排便参数的影响

无蔗糖山楂果丹皮对便秘小鼠排便参数的影响见表8。阴性对照组及比沙可啶组的首粒黑便排出时间显著短于模型组(P<0.05),6 h排出黑便的粒数及湿重显著高于模型组(P<0.05)。与模型组相比,50%木糖醇与50%低聚木糖复合果丹皮各剂量组的首粒黑便排出时间显著缩短(P<0.05),降低量分别为38.8%,39.2%和36.2%。蔗糖果丹皮组与复合果丹皮各剂量组相比,首粒黑便排出时间显著增加(P<0.05)。该结果表明山楂果胶虽有润肠通便的功能,但蔗糖的添加会导致果丹皮对小鼠便秘预防效果变差。其中,50%木糖醇与50%低聚木糖复合果丹皮中剂量组在缩短首粒黑便排出时间方面的效果最好。高剂量组在6 h排出黑便粒数和湿重方面的效果最好,其相比模型组增加率分别为92.5%和93.3%。表明不同剂量的低聚木糖/木糖醇(50∶50)复合果丹皮均有效地减少了便秘小鼠排便参数,缓解便秘症状,这可能是由于糖醇类物质可造成消化道渗透压升高而形成高渗环境,促进消化道内环境中水分增加,从而促进排便[25]。动物实验表明木糖醇具有缩短便秘小鼠的排便时间,增加粪便湿重等功效[26]。

表8 无蔗糖山楂果丹皮对便秘小鼠排便参数的影响Table 8 Effects of sugar-free hawthorn rolls on fecal parameters in mice model of constipation

2.6 无蔗糖山楂果丹皮对小鼠血清因子的影响

无蔗糖山楂果丹皮对便秘小鼠血清因子水平的影响见表9。阴性对照组的血清胃动素(MTL)及P物质(SP)含量均显著高于模型组(P<0.05),提高量分别为37.2%和70.6%。与模型组相比,蔗糖果丹皮、木糖醇果丹皮和低聚木糖果丹皮MTL和SP含量无明显差异,而不同剂量的低聚木糖/木糖醇(50∶50)复合果丹皮MTL和SP含量均得到提高,其中MTL含量分别增加24.0%,26.6%和25.1%;SP含量分别增加45.7%,49.2%和48.2%;比沙可啶组的MTL和SP含量分别增加29.3%和55.8%。该结果表明利用低聚木糖与木糖醇合理复配制备的果丹皮摄食后能够有效调节小鼠胃肠道蠕动,改善由便秘引起的胃肠道激素紊乱。与木糖醇果丹皮和低聚木糖果丹皮相比,不同剂量组的低聚木糖/木糖醇(50∶50)复合果丹皮MTL和SP含量无显著性差异,表明山楂果丹皮可通过降低小鼠血清MTL和SP含量来改善便秘,其中低聚木糖/木糖醇(50∶50)复合果丹皮中剂量组效果最佳。

表9 无蔗糖山楂果丹皮对便秘小鼠血清MTL、SP含量的影响Table 9 Effects of sugar-free hawthorn rolls on serum MTL,SP levels in mice model of constipation

2.7 无蔗糖山楂果丹皮对小鼠粪便中有机酸含量的影响

无蔗糖山楂果丹皮对便秘小鼠粪便中有机酸含量的影响见表10。小鼠粪便中的有机酸主要有乳酸、乙酸和丙酸。阴性对照组小鼠中乳酸、乙酸总含量均显著高于模型组(P<0.05),提高率分别为42.8%和81.7%,而丙酸降低了26.3%。与模型组相比,比沙可啶组的总酸含量无显著差异,阴性对照组及各果丹皮样品组的总酸含量显著增加(P<0.05),其中低、中、高三种剂量的低聚木糖/木糖醇(50∶50)复合果丹皮组总酸含量增加率分别为68.7%、72.8%和121.6%。其中,高剂量的低聚木糖/木糖醇(50∶50)复合果丹皮表现效果最好,乳酸和乙酸的含量分别较模型组增加117.1%和180.2%,而丙酸含量降低9.6%。表明山楂果丹皮饮食干预尤其是高剂量的低聚木糖/木糖醇(50∶50)复合果丹皮能有效提高便秘小鼠肠道内有机酸的含量。低聚木糖和木糖醇复合替代蔗糖制备果丹皮,摄食后促进小鼠粪便中产生大量的有机酸,其中较为突出的是能够明显地提高乙酸含量,这与Long等[27]研究结果类似。

表10 无蔗糖山楂果丹皮对便秘小鼠粪便中有机酸含量的影响Table 10 Effects of sugar-free hawthorn rolls on organic acid contents of faeces in mice model of constipation

3 讨论和结论

许多报道研究高糖食品中蔗糖替代,结果发现采用蔗糖替代物的复合可接近蔗糖在食品体系的相关性质。利用低聚果糖、异麦芽糖和甜菊糖苷替代了棉花糖中的蔗糖,结果提高了棉花糖的稳定性及抗氧化能力[28]。Rubioarraez等[29]则采用塔格糖与低聚果糖替代蔗糖制作柑橘果酱,结果表明果酱的弹性显著提高,且赋予了果酱粘稠的口感。本文将果丹皮中的蔗糖全部替换为低聚木糖、木糖醇或其复合物,并在此基础上制备了无蔗糖山楂果丹皮。

低聚木糖/木糖醇(50∶50)复合果丹皮组较模型组小鼠小肠推进率提高,首粒黑便排出时间缩短,黑便粒数和湿重增加。木糖醇果丹皮组在小肠推进率方面相比蔗糖果丹皮组显著增加,低聚木糖果丹皮组在首粒黑便排出时间方面相比蔗糖果丹皮组显著缩短,推测木糖醇果丹皮及低聚木糖果丹皮发挥便秘预防功效是山楂膳食纤维分别与木糖醇、低聚木糖产生协同增效作用。Matsumoto等[30]研究表明蔗糖摄入过多易引起血糖的升高,能够损害植物神经致胃肠蠕动无力,粪便不易排出。

便秘可诱发胃肠道激素的变化,特别是肠神经系统递质[31]。与模型组相比,不同类型果丹皮组均能升高便秘小鼠MTL和SP血清因子水平,尤其是低聚木糖/木糖醇(50∶50)复合果丹皮,说明低聚木糖和木糖醇复合能够更加有效地增加肠道内胃肠道激素的含量,调节胃肠道蠕动,改善由便秘引起的胃肠道激素紊乱。肠道内的短链脂肪酸是肠道微生物的发酵产物,调节肠道菌群来改善肠道微环境,刺激肠道蠕动从而有效地促进小肠代谢,推动肠道废弃物排泄,具有预防便秘的作用[32]。结果表明,与木糖醇果丹皮和低聚木糖果丹皮相比,低聚木糖/木糖醇(50∶50)复合果丹皮在促进乳酸和短链脂肪酸产生方面更为显著,从而能够有效地提高小肠推进率,缩短首粒黑便排出时间。

低聚木糖与木糖醇复合可替代传统果丹皮中的蔗糖,制备的无蔗糖山楂果丹皮与蔗糖山楂果丹皮的感官特性非常相近,同时低聚木糖/木糖醇(50∶50)复合果丹皮可有效预防便秘。因此,低聚木糖与木糖醇合理复合制备的果丹皮可作为一种无蔗糖且缓解便秘的功能食品。