超声辅助酶法提取西番莲果皮可溶性膳食纤维及理化性质

李 晗,杨宗玲,毕永雪,张 蕊,徐玉巧,范方宇,*

(1.西南林业大学林学院,云南昆明 650224;2.西南林业大学生命科学学院,云南昆明 650224)

西番莲(Passifloraedulis)是我国重要的热带水果之一,果皮含量约为50%。目前,西番莲主要用于果汁和饮料生产,果皮以丢弃为主,造成严重的资源浪费和环境污染[1]。而西番莲果皮干燥后制成的粉碳水化合物含量较高,可作为膳食纤维或生物活性提取物的来源,用于食品、医药和化妆品行业[1]。西番莲果皮粉(Passion Peel Flour,PPF)中可溶性膳食纤维(Soluble Dietary Fiber,SDF)含量约为35%[1]。西番莲果皮膳食纤维(PSDF)是一种低热量化合物,被认为是健康饮食的重要组成部分,可用于降低血清胆固醇和血糖含量,对胃肠道功能调节、辅助治疗心血管疾病和糖尿病有促进作用[2]。此外,PSDF在食品工业中也可广泛用于改善产品质地或改善营养[3]。

目前,SDF的提取方法包括化学法、酶法、微生物发酵法和超声波法等[4-5]。化学法操作简单、成本低,但酸碱和高热处理易破坏SDF结构;酶法条件温和,操作方便,所得SDF质量较好,但提取条件严格,费用较高;发酵法制得的SDF纯度较高,色泽、气味、分散程度和持水力等均优于化学法,但技术尚未成熟;超声波法提取SDF,可提高得率,缩短时间[4-5]。超声波通过液体介质时,液体和溶解气体的相互作用会产生声空化现象,会影响碳水化合物聚合形态和结构[6]。近年来,超声波技术由于其环保性,已广泛应用于食品工业领域。Zhang等[6]、Bagherian等[7]、Chen等[8]在SDF的提取研究中均发现,超声处理可有效提高SDF得率,并缩短提取时间。

基于此,研究采用超声波预处理辅助酶法提取PSDF,以料液比、酶解温度、超声功率、混合酶量四个因素进行单因素实验,结合正交实验优化PSDF提取条件,并对其理化性质进行分析。以期为PSDF的提取提供新的技术参考,为西番莲的综合利用开辟新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

西番莲 云南昆明;玉米油、猪油 重庆丰顺冷冻副食品粮油有限公司;柠檬酸(分析纯) 天津市风船化学试剂科技有限公司;α-淀粉酶(10000 U/g) 邢台万达生物工程有限公司;木瓜蛋白酶(100000 U/g) 南宁庞博生物工程有限公司;95%乙醇 天津市致远化学试剂有限公司;胆固醇(分析纯) 上海患世生化试剂有限公司;邻苯二甲醛(分析纯) 上海源叶生物科技有限公司;盐酸、硫酸、冰醋酸(分析纯) 云南杨林工业开发区汕滇药业有限公司。

DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司;UV-2600紫外可见分光光度计 岛津仪器(苏州)有限公司;SB25-12DTDS超声波清洗器 宁波新艺超声设备有限公司;CRT-400高速多功能粉碎机 永康市超然电器有限公司;DZKW-4电热恒温水浴锅 北京中兴伟业仪器有限公司;IKA RV10立式旋转蒸发仪 南京荣华科学器材有限公司;5804R台式冷冻离心机 德国艾本德股份公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 西番莲果皮洗净,60 ℃恒温干燥箱内干燥48 h。干燥果皮于超微粉碎机中粉碎,过60目筛,取筛下样品,得PPF,4 ℃环境密封保存备用。

1.2.2 粗PSDF提取工艺 称取5 g PPF于烧杯中,加入适量0.2%柠檬酸溶液,40 ℃超声提取30 min后取出,加入混合酶(α-淀粉酶∶木瓜蛋白酶=1∶1)酶解1 h,沸水浴灭酶10 min,冷却后加入样液体积的1/3的10%过氧化氢于45 ℃水浴脱色1 h,4000 r/min离心20 min,取上清液于50 ℃旋转蒸发仪中浓缩至原体积的1/3,加入浓缩液4倍体积的预热至60 ℃的95%乙醇,醇沉30 min,5000 r/min离心20 min,取沉淀50 ℃烘干,得到粗PSDF。得率以公式(1)计算。

PSDF得率(%)=(粗PSDF粉末质量/PPF质量)×100

式(1)

1.2.3 单因素实验 固定条件为:料液比1∶20 g/mL、酶解温度70 ℃、超声功率300 W、混合酶量0.4%。分别研究料液比(1∶14、1∶17、1∶20、1∶23、1∶26 g/mL)、酶解温度(50、60、70、80、90 ℃)、超声功率(200、250、300、350、400 W)、混合酶量(0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%)对粗PSDF得率的影响。

1.2.4 正交试验 在单因素实验基础上,以PSDF得率为评价指标,采用L9(34)正交试验优化提取工艺。正交试验因素水平见表1。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.5 理化性质测定 对PPF和PSDF分别进行理化性质测定。

1.2.5.1 溶胀性测定 参照陈良云等[9]的方法进行测定。称取0.500 g样品于10 mL量杯中,加入7 mL蒸馏水,振荡均匀,室温静置24 h,观察样品的自由膨胀体积。溶胀性以公式(2)计算。

溶胀性(mL/g)=(样品膨胀体积-干样品体积)/干样品质量

式(2)

1.2.5.2 持水力测定 参照陈良云等[9]的方法进行测定。称取0.500 g样品于离心管中,加入7 mL蒸馏水,混匀,室温静置24 h,4000 r/min离心20 min,弃上清液,称取剩余残渣质量。持水力以公式(3)计算。

持水力(g/g)=(离心后样品质量-离心前样品质量)/干样品质量

式(3)

1.2.5.3 堆积密度测定 参照Basanta等[10]的方法进行测定。称取一定质量的样品于10 mL量杯中,记录体积。堆积密度以公式(4)计算。

堆积密度(g/cm3)=样品质量/样品体积

式(4)

1.2.5.4 脂肪结合力测定 参照陈良云等[9]的方法进行测定。分别取0.500 g样品于10 mL离心管中,一个离心管加入10 g猪油(饱和脂肪酸结合力),另一个加入10 g玉米油(不饱和脂肪酸结合力),静置1 h,4000 r/min离心20 min,弃上层油,称重。脂肪结合力以公式(5)计算。

脂肪结合力(g/g)=(离心后样品质量-离心前样品质量)/干样品质量

式(5)

1.2.5.5 胆固醇吸附力测定 采用邻苯二甲醛法进行测定,参照齐慧等[11]的方法。

a.胆固醇标准曲线绘制:分别取0.3 mg/mL胆固醇标准溶液0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70 mL于比色管中,加入冰乙酸至0.8 mL,然后依次加入1 mg/mL邻苯二甲醛0.4 mL及混合酸(浓硫酸∶冰乙酸=1∶1)8 mL,静置15 min,于550 nm处测定各标准管吸光值。以吸光值为纵坐标(y),胆固醇含量(μg)为横坐标(x)绘制标准曲线。得到胆固醇标准曲线的回归方程:y=0.0093x-0.0116,R2=0.9993。

b.样品处理:取鲜鸡蛋蛋黄加入9倍体积蒸馏水,搅打成乳液。分别取0.500 g样品于锥形瓶中,加入25 mL稀释蛋黄液并搅匀,分别调节pH为2.0和7.0,于37 ℃,120 r/min摇床中振荡4 h,5000 r/min离心30 min。取0.1 mL上清液,采用邻苯二甲醛法测定样品胆固醇含量。胆固醇吸附力以公式(6)计算。

胆固醇吸附力(mg/g)=(吸附前蛋黄乳液胆固醇量-吸附后上清液胆固醇量)/干样品质量

式(6)

1.2.6 红外光谱测定 采用溴化钾压片法处理样品。称取适量样品与KBr粉末混匀并充分研磨。取少量粉末均匀放入压片机内,压片5 min后取出放入红外光谱仪中扫描,扫描范围为4000～400 cm-1。

1.3 数据处理

每组实验重复3次,实验结果以平均值±标准差表示。采用SPSS 20软件对数据进行方差分析和显著性检验,并用Origin 2017软件作图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 料液比对PSDF得率的影响 图1可见,料液比1∶14～1∶26 g/mL范围内,PSDF得率随料液比升高而增大,1∶26 g/mL时得率为11.18%(P<0.05)。这是因料液比过低时,溶液黏度大,不利于PSDF从样品中溶出;随料液比升高,增大了样品中PSDF在溶剂中的溶出机会,得率增大[12]。料液比1∶23～1∶26 g/mL范围的得率增加幅度明显低于1∶17～1∶23 g/mL,表明此时得率虽然还处于增加状态,但增幅已有所下降。料液比过高,提取液体积过大,在后期进行浓缩时所需时间增加,操作中的能耗和工序加大,同时需消耗大量乙醇溶液,生产成本增加[12]。综合考虑到提取效率减慢和生产成本增加,未选择继续扩大料液比。因此,选取1∶20、1∶23、1∶26 g/mL三个水平进行实验较为适宜。

图1 料液比对PSDF得率的影响Fig.1 Effects of solid/solvent ratio on PSDF yield注:字母相同表示差异不显著(P>0.05),字母不同表示差异显著(P<0.05)；图2～图4同。

2.1.2 酶解温度对PSDF得率的影响 图2可见,50～70 ℃时,PSDF得率随温度增加而增加,70 ℃时得率最高,为8.62%。可能是因温度升高加快了水分子运动速率,酶活力增加,促进了蛋白质、淀粉等物质酶解[5],从而增大PSDF得率。温度高于70 ℃后,PSDF得率显著下降(P<0.01),80 ℃时降低了14.15%。原因为温度升高,果胶发生热降解,果胶链降解成小分子寡聚糖和单糖;同时温度过高会抑制酶活性,降低酶的水解能力,阻碍了PSDF的溶出[5]。因此,酶解温度选取60、70、80 ℃三个水平较为适宜。

图2 酶解温度对PSDF得率的影响Fig.2 Effects of hydrolysis temperature on PSDF yield

2.1.3 超声功率对PSDF得率的影响 图3可见,超声功率200～300 W时,PSDF得率呈上升趋势,功率300 W时得率最高,为8.58%;当功率大于300 W时,得率降低。与相同条件下未经超声处理的PSDF得率相比显著提高了6.41%～19.49%(P<0.05),表明超声预处理可有效提高PSDF得率。超声处理可通过分子内加热和空化效应产生大量空化气泡,气泡破裂产生能量促进西番莲果皮组织细胞壁破裂和细胞物质释放,帮助溶剂进入组织细胞,增强细胞壁周围边界层的传质[5,13],促进PSDF的溶出。超声功率300～400 W时得率显著下降了10.96%(P<0.01)。可能是西番莲果皮组织细胞在超声波较强的机械剪切作用下,空化气泡塌陷产生的热效应和剪应力导致PSDF降解[5,13],降低了得率。因此,超声功率选取250、300、350 W三个水平较为适宜。

图3 超声功率对PSDF得率的影响Fig.3 Effects of ultrasonic power on PSDF yield

2.1.4 混合酶量对PSDF得率的影响 图4可见,PSDF得率随混合酶量增加呈先增大后减小的趋势。酶量0.2%～0.5%范围内,PSDF得率呈增加趋势;酶量0.5%时,PSDF得率最高,为9.9%。这是因为随着混合酶量的增加,会有更多的酶活性位点催化原料中淀粉和蛋白质等组分水解,从致密纤维结构中释放出PSDF[13],增大PSDF得率。混合酶量大于0.5%时,PSDF得率下降了3.43%(P>0.05)。可能是因酶量过高,PSDF质量浓度迅速增大,产物负反馈抑制效应增加,抑制了酶解反应的进行,造成水解度降低[14];同时,酶量过多也可能会破坏部分PSDF,降低PSDF得率。因此,混合酶量选取0.4%、0.5%、0.6%三个水平较为适宜。

图4 混合酶量对PSDF得率的影响Fig.4 Effects of mixed enzyme content on PSDF yield

2.2 正交实验

根据单因素实验结果,以料液比(A)、酶解温度(B)、超声功率(C)、混合酶量(D)进行正交实验。正交试验试果如表2所示。表2可见,影响PSDF得率由大到小的因素依次是A>D>B>C。PSDF提取最优条件是A3B2C1D3,即料液比1∶26 g/mL、酶解温度70 ℃、超声功率250 W、混合酶量0.6%,此时得到PSDF得率为14.82%。由表2可知,正交实验的PSDF得率整体大于单因素实验,这是因为试因素实验和正交实验分别采用了不同批次的西番莲,单因素实验中,西番莲为成熟后期,膳食纤维含量减少,因为成熟果皮中已有部分果胶水解为果胶酸,不被乙醇沉淀;正交实验中,西番莲为成熟初期,其膳食纤维含量较高。

表2 正交实验结果Table 2 Orthogonal experimental design and result

2.3 PPF与PSDF的理化性质分析

溶胀性和持水力是评价PSDF功能的重要指标,取决于颗粒大小、形状和疏水-亲水相互作用,与其降胆固醇能力密切相关[15]。溶胀性和持水力较高,可促进肠道蠕动、增加粪便体积和水分,使大便松软,易于有害物质快速排出体外,减轻直肠压力,预防便秘和结肠癌等[16]。表3可见,PSDF溶胀性与持水力分别为4.98 mL/g和4.93 g/g,与PPF相比差异极显著(P<0.01),分别增加了52.29%、19.66%。这可能是因为超声预处理破碎了果皮细胞壁,打开了纤维素分子间的部分氢键,亲水基团暴露,水结合部位增加[17],提高了PSDF水合性质。

表3 PPF与PSDF理化性质Table 3 Physicochemical properties of PPF and PSDF

堆积密度反映PSDF的疏松程度,堆积密度小的PSDF,其结构疏松,纤维空间和比表面积较大,具良好表面活性[10]。PSDF堆积密度为0.69 g/cm3,与PPF相比显著下降了24.18%(P<0.05)。因此,提取的PSDF表面活性较好。

PSDF对脂肪和胆固醇的结合能力是评价其对脂溶性组分吸附能力的重要指标[15]。表3可见,PSDF的饱和与不饱和脂肪结合力分别为1.55、1.29 g/g,相较于PPF分别增加了1.97%(P>0.05)、8.4%(P>0.05),表明PSDF脂溶性组分吸附能力有所提高。可能是超声处理破坏了PSDF原有致密结构,使亲水性基团和一些非极性基团更多地暴露出来[17],从而提高了PSDF脂肪结合力。

PPF和PSDF在模拟人体小肠环境(pH=7.0)的胆固醇吸附力均比胃环境(pH=2.0)高。这是因为酸性环境存在较多H+,使PPF、PSDF与胆固醇均带有部分正电荷,从而产生排斥力,减弱了PPF、PSDF与胆固醇的结合力[11];而PPF和PSDF在中性环境可以更好地吸收多余的脂肪,减少脂肪与胆汁接触,降低胆固醇含量[11]。表明反应体系酸碱性对胆固醇吸附力有一定影响。PSDF胆固醇吸附力相较于PPF分别显著增加了16.15%(pH=2.0,P<0.05)、10.47%(pH=7.0,P<0.05)。这是因为PSDF持水力更高(P<0.01),黏度更大,容易被肠道微生物发酵,产生短链脂肪酸,发挥生理调节功能,从而吸附胆固醇[2]。同时超声辅助预处理引起部分不溶性大分子纤维断裂,转变为小分子可溶性组分,微晶束减少,空间阻碍降低[18],提高了PSDF胆固醇吸附力。

2.4 PPF与PSDF的红外光谱分析

图5为PPF与PSDF中的红外光谱谱图。PPF与PSDF分别在3426.01、3435.67 cm-1处表现出较宽的拉伸强烈特征峰,与O-H的拉伸振动有关,表明PPF与PSDF中-OH和结合水分子较多;但PSDF的光谱峰强度有所下降,可能是脱水所致[19-20];PSDF在3435.67 cm-1处的峰形较宽,表明PSDF分子间氢键相互作用较强[21]。PPF在2917.72 cm-1处的C-H拉伸振动强度略高于2938.34 cm-1处的PSDF,可能是PPF中木质素、纤维素含量较多[21]。O-H和C-H的存在表明样品存在典型的多糖结构[20]。在1623.50、1628.01 cm-1处观察到PPF和PSDF都出现了糖分子中羰基C=O的伸缩振动,说明其存在糖醛酸[20,22];但PSDF中峰的强度明显小于PPF,表明PPF中醛基或羧基较多[20]。1400 cm-1左右的峰是C-H的振动,为碳水化合物中的-CH引起,是糖类的特征峰[21]。PSDF在1111.37 cm-1处吸收峰较强,可能是吡喃糖环的O-H变角振动吸收峰。此外,PPF和PSDF分别在1052.73、1019.88 cm-1处的强烈吸收带是碳水化合物的特征,归因于吡喃葡萄糖结构中C-O-H的O-H的变角振动和C-O-C环内醚中C-O的伸缩振动,也可能是伯醇的混合振动[20-21],是多糖的另一特征吸收峰。PSDF在619.18 cm-1处有一个较强吸收峰,可能存在游离的醇或酚[22]。综上,PPF和PSDF均可能含有酚类、糖类、胺类、醇类化合物,因含量或结合程度不同,导致其吸收强度有差异。

图5 PPF与PSDF的红外光谱图Fig.5 Infrared spectra of PPF and PSDF注:a:PPF;b:PSDF。

3 结论

正交试验结果可知,PSDF最佳提取条件为料液比1∶26 g/mL、酶解温度70 ℃、超声功率250 W、混合酶量0.6%,此时PSDF得率为14.82%。最佳工艺条件下提取的PSDF与PPF相比:PSDF溶胀性与持水力极显著增加了52.29%、19.66%(P<0.01);堆积密度为0.69 g/cm3,下降了24.18%(P<0.05),表明其纤维空间和比表面积增大,表面活性较好;饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸结合力分别增加了1.97%、8.4%(P>0.05),PSDF脂溶性组分吸附能力有所提高;模拟胃环境(pH=2.0)和肠道环境(pH=7.0)下的胆固醇吸附能力分别增加了16.15%、10.47%(P<0.05)。傅立叶红外光谱分析表明,PPF和PSDF均具有典型的多糖特征吸收峰。