一株高产丁酸的丁酸梭菌分离鉴定及其生物学性质研究

高文文,尚佳萃,周 雪,范小飘,李欣芮,赵 桉,赵鹏昊,赵 乐,孟祥晨

(东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨 150030)

人类肠道中定殖着大量的微生物,它们可以为机体提供营养并维持肠道健康。丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)是一类产芽孢的革兰氏阳性严格厌氧菌,最初分离于人类粪便。同时,也存在于土壤、污泥等自然环境中[1]。丁酸梭菌因其具有芽孢,所以具有较好的耐酸、耐胆盐等特性,从而可以更好地发挥维持肠道菌群平衡、促进有益菌增殖、抑制病原微生物、抗炎、促进动物生长、提高机体免疫力等益生功能[2-6]。因此,研究人员常将丁酸梭菌作为微生态制剂添加到食品、药品、饲料等多种领域以发挥多种益生作用[7-9]。近年来发现丁酸梭菌的许多益生作用可以归因于其代谢产物——丁酸,这是一种短链脂肪酸,对人类肠道发挥着重要的作用。它是人肠道上皮细胞的主要营养来源[10],保持一定水平的丁酸能够使结肠细胞保持稳定,进而发挥抑制癌症、调节肠道菌群失调等多种功能[11]。但当从食物中摄取丁酸时,其还未到达结肠发挥作用就已经被人体消化吸收,导致其很难发挥益生功能,因此,能在肠道部位产丁酸的细菌(如丁酸梭菌)就显得尤为重要。已有一些研究者从不同的生境分离出丁酸梭菌,谢树贵等[12]、袁华伟等[13]分别从窖泥中分离得到ClostridiumbutyricumB1和YD-4,王腾浩等[14]从猪粪中分离得到一株ClostridiumbutyricumZJU-F1,其在RCM梭菌增殖培养基中分泌丁酸的产量为1.87 g/L左右,廖秀冬[15]从土壤、污泥、猪和牛的新鲜粪便中分离得到多种Clostridiumbutyricum,其中在RCM液体培养基中培养后的丁酸产量最高为1.58 g/L。也有研究者从人类粪便中分离获得丁酸梭菌,Benamar等[16]从新生儿粪便样品中分离得到15株丁酸梭菌;杨帆[17]、杨金梅[18]、赵建新等[19]也分别从健康成人粪便中筛选到不同的丁酸梭菌。肠道内主要产丁酸细菌除了丁酸梭菌外,还包括普拉梭菌(Fusobacteriumprauznitzii)、罗氏弧菌(Roseburiaintestinalis)、霍氏真杆菌(Eubacteriumhallii)以及Butyricicoccuspullicaecorum等。方超等[20]从健康成人粪便中分离得到Fusobacteriumprauznitzii,其丁酸产量最高为1.4 g/L;Duncan等[21]从健康婴儿的粪便中分离得到五株Roseburiaintestinalis,其中丁酸产量最高为1.2 g/L,最低仅为0.8 g/L;同样地,Eeckhaut等[22]从鸡粪中筛选得到的Butyricicoccuspullicaecorum的丁酸产量也仅为1.1 g/L。综上所述,这些丁酸产生菌的丁酸产量都不高。有研究表明Clostridiumbutyricum是最有效的丁酸产生菌,在以葡萄糖作为碳源的分批发酵中丁酸产量可高达60 g/L[23]。从另一方面来说,F.prausnitzii和B.pullicaecorum等这类产丁酸细菌对氧极度敏感,即使在厌氧条件也很难存活,而相对来说C.butyricum较易培养,并且它又同时具备芽孢杆菌和乳酸菌的优点,其即具备较强的抗胁迫能力,又能在肠道这样的厌氧环境中生长良好,并产生乳酸和丁酸。因此,丁酸梭菌是一种极具潜力的能够生成丁酸的益生菌。

本研究旨在从健康人粪便中分离筛选高产丁酸的丁酸梭菌,并研究其生长特性、耐受特性、抗生素抗性等性质,从而为优良丁酸梭菌的应用开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

粪便样品 采集哈尔滨地区,年龄在20～25岁之间健康成人的新鲜粪便6份,在采样前一个月内,所有志愿者均未服用任何抗生素类药物,采集的新鲜粪便置于粪便还原液(L-半胱氨酸盐酸盐3 g/L,大豆蛋白胨2 g/L,121 ℃灭菌15 min[24])中迅速带回实验室;牛胆盐、胃蛋白酶(456 U/mg)、胰蛋白酶(3000 U/mg)、丁酸(色谱纯) 美国Sigma公司;浓硫酸 天津化学试剂一厂;细菌基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技有限公司;细菌微量生化反应管、药敏纸片 上海源叶生物科技有限公司;其他试剂均为国产分析纯产品。

厌氧培养罐、SPH-100生化培养箱 上海佳胜实验设备有限公司;Uvmini-1240紫外分光光度计 日本岛津公司;LW40B光学显微镜 上海光学仪器一厂;HH-1恒温水浴锅 万丰仪器制造有限公司;E2695Waters高效液相色谱仪 Waters公司;9700PCR扩增仪 美国Applied biosystem公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的配制 RCM梭菌增殖培养基:牛肉粉10.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母粉3.0 g、可溶性淀粉1.0 g、葡萄糖5.0 g、乙酸钠3.0 g、NaCl 5.0 g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g、琼脂20.0 g(固体培养基时用)、蒸馏水加至1000 mL,pH调至6.8±0.2,121 ℃高压灭菌15 min。

TSN梭菌选择性培养基:酵母浸膏10.0 g、胰蛋白胨15.0 g、亚硫酸钠1.0 g、柠檬酸铁0.5 g、硫酸新霉素0.05 g、多粘菌素B 0.02 g、蒸馏水加至1000 mL,pH调至7.2±0.1,121 ℃高压灭菌10 min,固体培养基加入琼脂13.5 g。

1.2.2 菌株的分离与培养 取采集的新鲜粪便与磷酸盐缓冲液(PBS)混合均匀后,于80 ℃条件下水浴10 min,然后在无菌操作台中吸取粪便稀释液于RCM梭菌增殖培养基中,并在37 ℃条件下厌氧培养48 h;然后将培养后样品进行梯度稀释,取适当稀释度下的稀释液涂布于TSN梭菌选择性培养基中,并在37 ℃条件下厌氧培养48 h;挑取菌落形态为不规则圆形、表面湿润光滑的单菌落进行平板划线,然后分别进行有氧、厌氧培养,从而选取严格厌氧的菌株进行镜检,所得到的符合丁酸梭菌菌体特征的革兰氏染色阳性菌株进行随后的试验[15]。

1.2.3 分离株产丁酸含量的测定 将从粪便中初步分离得到的丁酸梭菌疑似株以5%的接种量接种于RCM梭菌增殖培养基中,37 ℃厌氧培养16～20 h,连续液体培养2～3代,以保证菌株活力后进行后续试验。将活化好的丁酸梭菌疑似株接种到RCM液体培养基中培养24 h,取发酵液离心(12000 r/min,10 min)处理得到上清液后,采用高效液相色谱法测定发酵液中丁酸含量。丁酸的保留时间为24.571 min,质量浓度(g/L)与峰面积的回归方程为:y=1051800x(x代表质量浓度,y代表峰面积),其决定系数R2=1.000。

色谱条件[25]:色谱柱:Biorad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm,9 μm);流动相:5 mmol/L硫酸溶液;检测波长:210 nm;流速:0.5 mL/min;柱温:50 ℃;进样量:10 μL。

1.2.4 分离株鉴定

1.2.4.1 形态学特征 将筛选得到的菌株梯度稀释后涂布于RCM固体培养基中,厌氧培养24 h后观察菌落形态,并取单菌落进行革兰氏染色后,于光学显微镜下观察菌体形态。

1.2.4.2 生理生化试验和糖发酵试验 参照《伯杰细菌鉴定手册》[26],对分离株进行过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验、水解明胶试验、水解酪蛋白试验、运动性试验以及糖发酵试验。

1.2.4.3 16S rDNA同源性分析 细菌基因组DNA的提取、16S rDNA基因片段扩增反应的上下游引物、PCR扩增反应总体系以及扩增条件参照张秋雪等[24]的方法。

最后将扩增后得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,若扩增产物长度为1500 bp左右且无杂带,再将其送至测序公司进行双向测序。将测序结果在NCBI数据库中进行BLAST比对后,运用MEGA 7软件并采用Neighbor-Joining方法构建系统发育树,Bootstrap设置为1000。

1.2.4.4 多位点序列分型(MLST) 对分离株的七个管家基因进行PCR扩增并测序,其七个管家基因的上下游引物见表1[16]。

表1 丁酸梭菌MLST扩增引物Table 1 The MLST primers of Clostridium butyricum

管家基因的扩增体系与16S rDNA基因的扩增体系相同,其扩增反应条件为94 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30个循环;72 ℃延伸10 min。将各个管家基因扩增产物的测序结果按顺序拼接并经BLAST比对后,构建系统发育树,进一步分析分离株的亲缘关系。

1.2.5 分离株生长曲线和丁酸生成量曲线的测定 按照5%的接种量将活化后的菌株接种于RCM液体培养基中,37 ℃厌氧培养24 h,每间隔2 h取1次培养液,测其OD600值、pH以及丁酸生成量,然后以取样时间为横坐标,OD600值、pH和丁酸生成量为纵坐标绘制生长曲线图和丁酸生成量曲线图。

1.2.6 耐受性试验 a.收集菌体:将充分活化好的待测菌株以5%的接种量接种于RCM液体培养基中,37 ℃厌氧培养12 h,即得菌悬液。然后取一定量的菌悬液进行离心处理(8000 r/min,10 min)以收集菌泥,并用PBS缓冲液洗涤两次。

b.酸耐受性:用PBS缓冲液将洗涤后的菌泥重悬,并将菌悬液的pH分别调节为2.0和3.0,然后于培养0、1和3 h时取样测定酸耐受性[27]。

c.胆盐耐受性:将洗涤后的菌泥重悬于0.3%、0.5%和1%浓度的胆盐溶液中,在37 ℃条件下厌氧培养0、4和8 h后取样测定胆盐耐受性[27]。

d.模拟消化道耐受性:本试验模拟菌体经过唾液、胃液以及肠液的消化过程。唾液、胃液以及肠液的具体配制方法参照Barmpalia-davis等的方法[28]。将洗涤后的菌体进行模拟唾液消化5 min,胃液消化2 h,肠液消化2 h[29]。

e.存活率的测定:取样后进行梯度稀释,取适宜浓度梯度涂布于RCM固体培养基中,37 ℃厌氧培养48 h后进行菌落计数。采用平板菌落计数法计数耐受性试验起始和结束后的活菌数量,然后计算存活率。

1.2.7 抗生素抗性试验 本试验采用药敏纸片扩散法[30]。将待测菌株以5%的接种量接种于RCM液体培养基中,37 ℃厌氧培养12 h后,吸取0.1 mL菌悬液均匀涂布于RCM固体培养基上,待培养基表面干燥后,分别镊取各种药敏纸片贴于培养基表面,37 ℃厌氧培养48 h后,用游标卡尺测量抑菌圈直径。

1.3 数据分析

以上所有试验均进行3次重复。运用Origin 9.0对试验所得数据进行绘图,运用SPSS 23进行差异性分析(P<0.05)。

2 结果与讨论

2.1 分离株的筛选及其所产丁酸含量

选取6份健康成人的新鲜粪便进行梯度稀释以及涂布平板,随机挑取14株单菌落,其显微形态和丁酸产量见表2。根据丁酸梭菌的菌体形态、芽孢位置、是否严格厌氧、生理生化特征以及丁酸产量筛选得到1株高产丁酸的菌株,在RCM培养基中培养24 h后发酵液中丁酸含量达到2.156 g/L,将其命名为C1-6。本研究获得菌株的丁酸产量高于王腾浩等[14](ClostridiumbutyricumZJU-F1,在RCM培养基中丁酸生成量为1.87 g/L)和廖秀冬等[15](ClostridiumbutyricumNF3,在RCM丁酸生成量为1.58 g/L)的结果。

表2 分离菌株的菌体形态和丁酸产量Table 2 Microscopic morphology and butyric acid production of isolated strains

2.2 分离株的鉴定

2.2.1 形态学特征 分离株C1-6在RCM固体培养基上培养24 h后,菌落直径为1～3 mm,乳白色、稍透明、不规则圆形、边缘不整齐、表面湿润光滑、菌落挑起后成拉丝状(图1A)。菌体成短杆状,单个或成对出现,芽孢次端生,革兰氏染色阳性(图1B)。

图1 分离株C1-6菌落(A)及菌体(B)形态Fig.1 Colony(A)and cell morphology(B)of isolated strain C1-6

2.2.2 生理生化及糖发酵试验 经生理生化和糖发酵试验后,根据伯杰氏细菌鉴定手册的描述[26],丁酸梭菌为硝酸盐还原阳性,过氧化氢酶、水解明胶与酪蛋白阴性,蜜二糖和淀粉利用阳性,松三糖利用阴性等初步确定分离株C1-6为丁酸梭菌(表2)。

表2 分离株的生理生化和糖发酵鉴定结果Table 2 Physiological biochemical and sugar fermentation identification results of isolated strains

2.2.3 16S rDNA序列同源性分析 以分离株C1-6的DNA为模板,采用通用引物进行PCR扩增反应,获得约1500 bp长度的扩增产物,将测序拼接结果进行同源性分析并构建系统发育树(图2),结果显示分离株C1-6与ClostridiumbutyricumCDC51208和ClostridiumbutyricumTK520处于同一分支且同源性达到100%。

图2 基于16SrDNA基因构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree constructed based on 16S rDNA gene

2.2.4 多位点序列分型(MLST) 以分离株C1-6的DNA为模板,对其七个管家基因进行PCR扩增,获得七个300 bp左右长度的扩增产物(图3),单个管家基因扩增后测序所得序列经blast比对后均与之前的16S rDNA基因比对结果一致。将七个管家基因序列依次拼接起来,长度约为2100 bp,经Blast比对后构建系统发育树(图4)。结果表明,MLST分型结果与16S rDNA同源性分析结果一致,但基于MLST分型方法构建的系统发育树更能够反映出分离株C1-6与所选参考菌株之间进化距离的差异,同时通过发育树可以看出,菌株C1-6与C.butyricumCDC51208被更进一步分成同一小支,亲缘关系为100%,而与同源性较高的ClostridiumbutyricumTK520存在系统发育上的差异。

图3 等位基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果Fig.3 Agarose gel electrophoresis results of allele amplification products注:M:D2000;1～7:等位基因1～7。

图4 基于七个等位基因构建的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree constructed based on seven alleles

2.3 丁酸梭菌C1-6的生物学性质

2.3.1 生长曲线、pH曲线及丁酸生成量 将菌株C1-6接种于RCM液体培养基中于37 ℃下培养24 h,以培养时间为横坐标,OD600、pH和丁酸生成量为纵坐标绘制生长曲线(图5)和丁酸生成量曲线(图6)。由图5～图6可知,菌株C1-6在0～4 h为生长迟滞期,4 h后进入对数生长期,12 h后进入稳定期,表明C1-6的生长速度较快。到达稳定期后,其OD600基本保持不变,最终稳定在1.7左右。丁酸梭菌在发酵过程中,产生大量丁酸、少量乳酸和乙酸等脂肪酸而使pH有所降低。处于生长期的菌株与处于迟滞期的相比,生长更加旺盛,因此,处于生长期的菌株pH变化量更大,而步入稳定期后菌株的生长逐渐稳定,代谢产物变化量不大,从而导致pH也趋于稳定,最终稳定在4.6左右。丁酸生成量曲线的走向与其生长曲线大致相同,其在4～8 h时丁酸变化量最大,约为1 g/L左右,其生成量最终稳定在2.1 g/L左右。

图5 丁酸梭菌C1-6的生长曲线和pH曲线Fig.5 Growth curve and pH curve of C1-6

图6 丁酸梭菌C1-6的丁酸生成量曲线Fig.6 Butyric acid production curve of C1-6

2.3.2 耐受性

2.3.2.1 酸耐受性 由图7可知,丁酸梭菌C1-6在pH2和pH3的条件下,其活菌数随孵育时间的延长逐渐下降。在pH2的条件下孵育1和3 h后,C1-6的存活率显著降低(P<0.05),分别为83.3%和72.5%。在pH3的条件下,当孵育1 h时,其活菌数与孵育初始时相比没有显著变化(P>0.05),当孵育3 h后,其存活率显著降低到91.8%(P<0.05),酸性越强对丁酸梭菌的的胁迫就越大。SchoNherr等[31]研究发现有8株丁酸梭菌在pH3的酸性条件下,表现为不生长或生长较弱。由此可知,本试验菌株C1-6具有更好的酸耐受性。

图7 丁酸梭菌C1-6在不同酸性条件下的存活率Fig.7 Survival rate of C1-6 under different acidic conditions注:不同字母表示差异显著(P<0.05)。图8、图9同。

2.3.2.2 胆盐耐受性 当丁酸梭菌C1-6在不同胆盐浓度条件下孵育3 h后,发现其存活率随胆盐浓度升高而增大,但在0.3%和0.5%的胆盐浓度下的存活率差异不显著(P>0.05)。当胆盐浓度为1%时,其存活率与0.3%和0.5%胆盐处理组相比显著增加(P<0.05),最终存活率为104.63%,但在1%的胆盐条件下的存活率与空白对照组相比差异不显著(P>0.05)。以上结果表明,该菌具有较强的胆盐耐受性,而且一定浓度的胆盐溶液不但没有明显抑制其生长,反而对其生长具有促进作用(图8)。这可能是因为胆盐能够促进丁酸梭菌芽孢的形成,反而提高其抗胁迫能力。但刘磊等[32]研究发现,丁酸梭菌CBM01在0.4%以下的胆盐浓度中可以生长,在0.5%的胆盐溶液中却生长较差,这可能是由于菌株的胆盐耐受性还与其细胞表层蛋白、细胞膜脂肪酸以及分泌的胆盐水解酶种类等有关,而不单单与芽孢的存在相关,因此不同菌株之间会存在一定的胆盐耐受差异性。

图8 C1-6在不同胆盐浓度条件下的存活率Fig.8 Survival rate of C1-6 under different bile salt concentrations

2.3.2.3 对模拟消化道环境的耐受性 在人体消化道中不仅存在酸和胆盐,还存在各种消化酶,因此,益生菌通过连续模拟消化道试验能够更好地反映菌株对肠道环境的耐受性。为了研究丁酸梭菌C1-6对模拟消化道环境的耐受性,将其依次经过模拟唾液5 min、胃液2 h以及肠液2 h的处理后,存活率分别为98.44%、94.81%和93.06%。虽然存活率略有下降,但最终仍能保持在93%左右,表明该菌株对模拟消化道环境具有较强的耐受性。其中模拟唾液对菌株存活率的影响最小,模拟胃液对存活率的影响最大,而且显著高于模拟唾液和肠液对菌株存活率的影响(P<0.05)(图9)。与单纯的酸性环境相比,C1-6在模拟消化道环境中的存活率更高,这可能是因为胃蛋白酶使酸性条件的极化程度变得不明显,从而削弱了酸对菌体细胞的迫害[33]。而因为酸胁迫对C1-6的影响更明显,导致其在胃液中的存活率下降明显高于肠液。虽然本试验仅模拟了酸、胆盐以及消化酶对菌株的影响,没有考虑其他影响因素,但对于具有良好耐受性益生菌的筛选仍具有借鉴意义。

图9 丁酸梭菌C1-6历经模拟消化道环境后的存活率Fig.9 Survival rate of C1-6 after simulated digestive tract environment

2.3.3.4 丁酸梭菌对抗生素的抗性 本试验检测了丁酸梭菌C1-6对10种抗生素的敏感性,并将S.aureusATCC25923作为质控菌株,质控范围依据NCCLS药敏试验标准执行。试验结果表明:该菌对青霉素、氯霉素、卡那霉素、庆大霉素、克林霉素具有抗性,对红霉素中度敏感,对氨苄西林、四环素、万古霉素、头孢呋辛敏感(表3)。

表3 丁酸梭菌C1-6对几种抗生素的抗性Table 3 Resistance of Clostridium butyricum C1-6 to several antibiotics

Isa等[34]评估了ClostridiumbutyricumMIYAIRI 588和C.butyricumATCC 19398T的抗生素抗性,发现其均对庆大霉素、卡那霉素、链霉素等氨基糖苷类抗生素具有抗性,而对人类和动物治疗中其他重要的抗生素类别都非常敏感。王腾浩等[14]研究发现,C.butyricumZJU-F1除对氧氟沙星和克林霉素呈中度敏感外,对大多数氨基糖苷类抗生素均具有抗性,此外,对大多数青霉素类、四环素类以及头孢类抗生素均具有敏感性。谢树贵等[12]的研究表明,C.butyricumB1对庆大霉素和卡那霉素具有抗性。同样地,本研究筛选得到的C.butyricumC1-6也对庆大霉素等氨基糖苷类抗生素具有抗性。由此表明,大多数丁酸梭菌对氨基糖苷类抗生素都呈现抗性,这可能是因为这类抗生素不能透过它们的微生物细胞膜[35],这是一种物理性的内在特征,而不是遗传或代谢特性。与前人研究不同的是,C1-6表现出对青霉素的耐药性,但这种抗性基因是否具有转移的风险还有待进一步研究。

3 结论

本试验从健康成人新鲜粪便中,通过选择性培养基筛选得到一株丁酸产量较高的丁酸梭菌,其在RCM液体培养基中丁酸的产量可达2.1 g/L左右,并从形态学、生理生化特征、16S rDNA序列同源性以及多位点序列分型(MLST)等方面将其确定为丁酸梭菌,命名为C1-6。

本试验筛选得到的丁酸梭菌C1-6在pH2和pH3的酸性条件下孵育3 h后存活率分别为72.5%和91.8%。在1%的胆盐溶液中培养3 h后存活率与空白对照组相比没有显著变化(P>0.05),但显著高于0.3%和0.5%的胆盐溶液处理组(P<0.05)。历经模拟唾液、胃液、肠液的连续模拟消化道环境后其存活率分别为98.44%、94.81%和93.06%。由此说明,丁酸梭菌C1-6具有较强的耐酸、耐胆盐以及耐受模拟肠道环境能力。同时由于在酸性条件下丁酸梭菌的终产物丁酸会进一步抑制其自身的生长[36],从而导致与胆盐胁迫相比,酸胁迫对丁酸梭菌的影响更大。抗生素抗性试验结果表明,菌株C1-6对青霉素具有耐药性,需进一步评价其耐药基因的转移风险。以上初步研究结果表明丁酸梭菌C1-6具有潜在的应用价值,但在使用之前应更全面地评估该菌株的安全性和益生功能。