黄花倒水莲不同极性部位抗氧化和降血糖活性研究

姚志仁,李 豫,朱开梅,唐 辉,顾生玖,*

(1.桂林医学院药学院,广西桂林 541100;2.广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所,广西桂林 541100)

黄花倒水莲(PolygalafallaxHemsl.)为远志科远志属灌木或小乔木,又名假黄花远志、黄花参、倒吊黄、吊吊黄、念健、一身保暖、鸭仔兜等,其生长于山谷林下水旁荫湿处,主要分布于江西,福建、湖南、广西和云南等地区[1]。黄花倒水莲根入药,性平,味甘、微苦有补气血、利水渗湿、补脾补肝、活血调经的功效,一般用于治疗病后体虚、腰膝酸痛、跌打损伤、急慢性肝炎及抗衰老等[2]。其是壮族、瑶族、苗族等少数名族的常用药[3],同时黄花倒水莲也作为少数民族药食两用药材[4]。近年来黄花倒水莲的药用价值被逐渐重视。

糖尿病是严重影响人体健康的疾病。糖尿病的发生与氧化有密切关系[5-6],抗氧化剂可减少自由基的产生或直接淬灭体内产生的自由基,并增强机体的抗氧化能力,是预防和治疗糖尿病及其并发症的有效手段[7],淀粉中的葡萄糖以α-1,4糖苷键和α-1,6糖苷键的形式连接。α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的参与是人体对食物中淀粉的消化吸收所必须的过程。唾液、肠道内淀粉酶的活性可以通过α-淀粉酶抑制剂来抑制,从而阻碍食物中淀粉的消化吸收,来起到降血糖的作用[8]。目前常用的抗氧化剂及α-葡萄糖苷酶抑制剂多为西药,存在较多毒副作用,也不能有效地控制并发症,植物天然产物降糖作用具有多途径、多靶点、多向性的药理特点,不仅可降低血糖,还具有抗氧化及降血脂作用[9-11]。α-葡萄糖苷酶抑制剂一般具有单糖或者寡糖结构,可有效地抑制糖水解酶的活性,起到有效控制糖尿病患者餐后血糖水平作用[12]。除此之外,α-葡萄糖苷酶抑制剂还具有抗癌、抗艾滋病病毒、抗动脉粥样硬化等作用[13]。本文采用不同极性的溶剂对黄花倒水莲乙醇提取物进行萃取,并测定其各部位多酚,黄酮含量。同时对各部位进行了抗氧化以及抑制α-葡萄糖苷酶活性的测定,为进一步研究和开发利用该植物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄花倒水莲药材 中国科学院广西植物研究所提供,由中国科学院广西植物研究所唐辉研究员鉴定为远志科植物黄花倒水莲(PolygalafallaxHemsl)的干燥根茎;ABTS试剂盒 碧云天生物技术公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 梯希爱(上海)有限公司;抗坏血酸(VC) 天津福晨化工试剂公司;α-葡萄糖苷酶(5×106U/mL)、4-硝基苯-α-D-葡萄糖苷(pNPG) Sigma公司;阿卡波糖 百灵威科技有限公司;福林一酚(Folin-Ciocalteu)试剂 生工生物工程股份有限公司;没食子酸 成都市科龙化工试剂厂;槲皮素 天津一方科技有限公司;所有分离用有机溶剂 均为国产分析纯。

HC-350型四两装高速中药粉碎机 武义海纳电器有限公司;LQ-C30002型乐祺电子天平 上海瑶新电子科技有限公司;ReadMax 1900型全波长Epoch酶标仪 上海闪谱生物科技有限公司;N-1210BV-W型EYELA旋转蒸发仪 上海巴玖实业有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黄花倒水莲提取物及萃取物制备 取自然风干的黄花倒水莲干燥品,粉碎,过40目筛,称取粗粉800 g按料液比1∶10加入95%乙醇,室温浸泡一周,抽滤并收集滤液,60 ℃旋转蒸发得黄花倒水莲乙醇提取物,按照同样方法提取三次。

采用有机溶剂萃取法[14-15]对黄花倒水莲乙醇提取物进行纯化,称取适量乙醇提取物用纯净水稀释,采用等体积石油醚反复萃取样品至石油醚层无色,采用同样方法分别用乙酸乙酯、正丁醇、氯仿为萃取剂进行萃取,得各部位萃取物以及萃取完剩下的水相部分。

1.2.2 黄花倒水莲醇提物各萃取物中多酚含量的测定 参照国标法GB/T 8313-2008《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》[16]中的多酚测定方法,配制一定浓度的没食子酸标准溶液和待测液,在760 nm处测定吸光度。

1.2.2.1 标准曲线的绘制 参考文献方法[17]并做修改称取适量干燥没食子酸标准品,纯水稀释,配制成0.02 mg/mL没食子酸标准溶液。分别取0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.25 mL没食子酸标准溶液参照国标法,于760 nm处分别测定其吸光度。

1.2.2.2 多酚含量测定 按照国标法配制[16]待测样品溶液,于760 nm处测定其吸光度,以超纯水代替待测样品为空白对照。每组实验平行测定三次。各待测样品多酚含量表示为mg(没食子酸当量)/g(黄花倒水莲各部位质量)计算公式如下:

待测样品中多酚含量 Z=cvk/m

式中:c为待测样品稀释后的多酚浓度(mg/mL)由标准曲线拟合得出;v为黄花倒水莲各待测样品提取液总体积(mL);k为待测样品提取液稀释倍数;m为黄花倒水莲各部位粉末重量(g)。

1.2.3 黄花倒水莲醇提物各萃取物中黄酮含量的测定

1.2.3.1 标准曲线的制备 参考文献方法[18]并做修改称取适量干燥槲皮素标准品,纯水稀释,配制成0.125 mg/mL标准溶液。分别吸取标准液0、2、4、6、8、10 mL于25 mL容量瓶中,加入质量分数为5%的NaNO2溶液0.7 mL,摇匀,溶液颜色无明显变化,静置5 min,加入质量分数为10%的Al(NO3)3溶液0.7 mL,再摇匀,颜色变浅,放置5 min后,加入5 mL质量分数为20%的NaOH溶液,颜色变成红色,再用60%乙醇定容至刻度线,摇匀,静置15 min,测其在510 nm处吸光度值。

1.2.3.2 黄酮含量测定 按照文献方法[19]配制待测样品溶液,于510 nm处测定其吸光度,以超纯水代替待测样品为空白对照。每组实验平行测定三次。各待测样品黄酮含量表示为mg(槲皮素当量)/g(黄花倒水莲各部位质量)计算公式如下:

待测样品中黄酮含量Z=cvk/m

式中:c为待测样品稀释后的黄酮浓度(mg/mL)由标准曲线拟合得出;v为黄花倒水莲各待测样品提取液总体积(mL);k为待测样品提取液稀释倍数;m为黄花倒水莲各部位粉末重量(g)。

1.2.4 ABTS法测定各极性部位总抗氧能力

1.2.4.1 ABTS工作液的制备 按试剂盒说明取相同体积的ABTS溶液以及氧化剂溶液,室温避光存放12～16h后,用80%乙醇稀释至35～55倍。

1.2.4.2 标准曲线的制备 按ABTS试剂盒方法96孔板内加入200 μL的ABTS工作液再加入10 μL(0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5 mmol/L)的Trolox溶液。轻轻混匀,室温孵育2～6 min后于405 nm波长处测定吸光度。

1.2.4.3 总抗氧能力测定 96孔板内加入200 μL ABTS工作液,空白对照组加入10 μL PBS,样品组加入10 μL不同浓度(0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL)样品。轻摇混匀。室温孵育2～6 min,在405 nm处测定吸光度。根据标准曲线计算出样品总抗氧能力。

1.2.5 清除羟自由基活性测定 参考文献方法[20-21],将黄花倒水莲各部位分别稀释为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL的溶液,相同浓度的VC溶液做对照。取1 mL样品,分别加入1.8 mmol/L FeSO4溶液2 mL和1.8 mmol/L水杨酸-乙醇溶液1 mL,再加入0.03% H2O2溶液0.1 mL在37 ℃反应30 min,8000 r/min离心10 min,510 nm测定吸光度。样品对羟自由基的清除率按公式计算

羟自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中:A1:1.0 mL提取液+2.0 mL FeSO4溶液+1 mL水杨酸-乙醇+H2O2溶液;A2:1.0 mL提取液+2.0 mL FeSO4溶液+1 mL水杨酸-乙醇+蒸馏水A0:1.0 mL蒸馏水+2.0 mL FeSO4溶液+1 mL水杨酸-乙醇+H2O2溶液。

1.2.6 清除DPPH自由基活性测定 参考文献方法[22-23]采用DPPH法。2 mL黄花倒水莲提取物和萃取物乙醇溶液加入1 mL浓度为500 μmol/LDPPH-乙醇溶液。混合均匀后室温避光反应30 min,然后在517 nm波长处测吸光度。阳性对照为VC,样品对DPPH自由基的清除率按公式计算。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中:A1:2.0 mL提取液+1.0 mL DPPH工作液;A2:2.0 mL提取液+1.0 mL无水乙醇;A0:2.0 mL纯水+1.0 mL DPPH工作液。

1.2.7 不同溶剂黄花倒水莲提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用 参考文献方法[24-25]取10 μL不同浓度(0.25、0.5、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL)的黄花倒水莲提取物加入96孔板内,再分别加入10 μL pH7.4磷酸缓冲盐溶液,10 μL 0.5 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液,充分混匀后放置37 ℃孵育15 min,再加入20 μL 3 mmol/L的PNPG溶液,再孵育10 min,加入150 μL 0.1 mol/L的Na2CO3溶液终止反应。利用酶标仪在405 nm处测定吸光度,分别设置空白组、对照组、样品对照组。并计算其IC50大小。按照表1加样进行实验,同时以阿卡波糖为阳性对照。

表1 α-葡萄糖苷酶的抑制作用加样表Table 1 Inhibitory sampling table of alpha-glucosidase

提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用按公式计算:

抑制率(%)=(1-(A1-A2)/A3)×100

式中:A1为样品组吸光;A2为空白组吸光值;A3为对照组吸光值。

1.3 数据处理

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量数据用均数±标准差表示,进行检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 黄花倒水莲乙醇提取物及各萃取物多酚的含量

2.1.1 标准曲线的绘制 经线性拟合得回归方程Y=19.04X+0.028,决定系数R2=0.9924,实验表明没食子酸在0.01～0.05 mg/g浓度范围内没食子酸浓度与吸光度呈现良好的线性关系(Y为吸光度,X为没食子酸浓度)。

图1 没食子酸标准曲线Fig.1 Gallic acid standard curve

2.1.2 黄花倒水莲醇提物各萃取物多酚含量 黄花倒水莲各部位多酚含量见表2。

表2 黄花倒水莲醇提物各部位的多酚含量Table 2 Polyphenol content in different parts of alcohol extract of P. fallax.

实验测得乙酸乙酯部位多酚含量高达(483.9±0.8) mg/g,远高于其他部位多酚含量。黄花倒水莲各萃取物中多酚含量依次为乙酸乙酯部位>氯仿部位>正丁醇部位>石油醚部位>水层部位。该结果表明黄花倒水莲的多酚集中分布于乙酸乙酯部位,小极性的多酚所占比例较少。采用系统溶剂萃取法对黄花倒水莲进行分段萃取后可达到多酚的初步富集与分离的目的。

2.2 黄花倒水莲乙醇提取物及各萃取物黄酮的含量

2.2.1 标准曲线的绘制 经线性拟合得回归方程Y=1.365X+0.001,决定系数R2=0.9931,实验表明槲皮素在0.00～0.05 mg/mL浓度范围内槲皮素浓度与吸光度呈现良好的线性关系(Y为吸光度,X为槲皮素浓度)。

图2 槲皮素标准曲线Fig.2 Quercetin standard curve

2.2.2 黄花倒水莲各萃取物黄酮含量 黄花倒水莲各萃取物黄酮含量测定结果见表3。

表3 黄花倒水莲各部位的黄酮含量Table 3 Flavone content in different parts of P.fallax.

实验测得石油醚部位黄酮含量高达(53.1±0.57) mg/g,远高于其他部位黄酮含量。黄花倒水莲各萃取物中黄酮含量依次为石油醚部位>乙酸乙酯部位>氯仿部位>醇提总>正丁醇部位>水层部位。该结果表明黄花倒水莲的黄酮集中分布于石油醚部位。且经过初步分离后,石油醚部位黄酮含量远高于醇提物黄酮含量说明采用系统溶剂萃取法对黄花倒水莲进行分段萃取后可达到黄酮的初步富集与分离的目的。

2.3 ABTS法测定黄花倒水莲各萃取部位总抗氧能力

采用总抗氧能力检测试剂盒(ABTS法)对黄花倒水莲各提取物进行抗氧化活性检测,结果显示各提取物均有一定的抗氧化活性。

2.3.1 Trolox标准曲线 Trolox的标准曲线见图3。

图3 Trolox标准曲线Fig.3 Trolox standard curve

2.3.2 各萃取物的总抗氧能力 如图4所示黄花倒水莲各极性部位均有一定的抗氧化能力,且在0～0.8 mg/mL浓度范围内,各萃取层总抗氧能力随着浓度的增长而增长,总体呈现线性关系。且其抗氧化能力顺序为乙酸乙酯部位>石油醚部位>氯仿部位>正丁醇部位>醇提部位>水相部位,乙酸乙酯部位总抗氧能力在0.8 mg/mL时高达(1.027±0.031) mmol·L-1,远高于同浓度下其他各部位。

图4 黄花倒水莲各部位总抗氧能力Fig.4 Total antioxidant capacity of various parts of P.fallax

2.4 对羟自由基的清除能力

黄花倒水莲乙醇提取物及其各萃取物对羟自由基均表现出不同程度的清除作用,实验结果如图5所示。在实验浓度范围内乙酸乙酯部位清除羟自由基的活性最强,乙酸乙酯部位在浓度0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL对羟自由基的清除率分别为57.1%、64.2%、64.9%、79.0%、92.8%,乙酸乙酯部位各浓度对羟自由基的清除率均高于同浓度下其他各部位清除作用与阳性对照品VC相当,而0.8 mg/mL浓度下氯仿部位、正丁醇部位、石油醚部位、醇提部位、水相部位清除率分别为83.2%、72.6%、67.0%、61.2%、50.7%。黄花倒水莲醇提物及其各萃取物对羟自由基清除率大小依次为:乙酸乙酯部位>氯仿部位>正丁醇部位>石油醚部位>醇提部位>水相部位。黄花倒水莲具有抗氧化活性的成分主要集中在乙酸乙酯部位。

图5 各萃取极分对羟自由基清除率Fig.5 Scavening rate of extraction fraction against ·OH

2.5 对DPPH自由基清除作用

黄花倒水莲醇提物及其各提取部位清除DPPH自由基活性测定结果如图6所示,黄花倒水莲醇提物及其各提取部位对DPPH自由基显示出不同程度的清除活性,随着浓度升高,对DPPH自由基清除率呈现线性关系;乙酸乙酯部位在浓度0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL时对DPPH自由基清除率分别为62.9%、69.1%、77.7%、87.6%、93.3%;而当浓度为0.8 mg/mL时,正丁醇部位、氯仿部位、石油醚部位、醇提部位、水相部位清除率分别为83.4%、79.3%、70.2%、68.8%、50.2%,乙酸乙酯部位各浓度对DPPH自由基清除率均远高于同浓度下其他部位。黄花倒水莲各部位对DPPH自由基的清除率大小顺序为乙酸乙酯部位>正丁醇部位>氯仿部位>石油醚部位>醇提物>水相部位。

图6 各萃取极分对DPPH自由基清除率Fig.6 Scavenging rate of each extraction fraction against DPPH free radical

2.6 不同溶剂黄花倒水莲萃取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

不同溶剂黄花倒水莲萃取物对α-葡萄糖苷酶的半抑制率(IC50)和不同溶剂萃取物的抑制作用结果见图7。

图7 不同萃取物对α-葡萄糖苷酶的半抑制率Fig.7 Semi-inhibitory rate of different extracts on α-glucosidase

通过黄花倒水莲不同浓度(0.25、0.5、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL)抑制率计算其IC50。各有效部位均对α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用,乙酸乙酯部位抑制效果最为明显。黄花倒水莲各部位对α-葡萄糖苷酶的抑制效果:乙酸乙酯部位>正丁醇部位>氯仿部位>醇提物>石油醚部位>水相部位。而乙酸乙酯部位IC50为(0.064±0.013) mg/mL,正丁醇部位为IC50为(0.559±0.012) mg/mL均要优于阳性对照阿卡波糖IC50(0.867±0.032) mg/mL。说明黄花倒水莲中发挥α-葡萄糖苷酶抑制作用的活性成分主要溶解在乙酸乙酯部位。

3 结论

本研究表明黄花倒水莲各极性部位均有一定的抗氧化活性,相同质量浓度下乙酸乙酯部位抗氧化活性优于其他部位。乙酸乙酯部位多酚含量最高(483.9±0.8) mg/g,而黄酮含量最多的为石油醚部位(53.1±0.57) mg/g,表明在黄花倒水莲中总多酚有较好的抗氧化活性作用。通过实验证明其乙酸乙酯部位对α-葡萄糖苷酶抑制效果远远高于阳性对照阿卡波糖。阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的半抑制率(IC50)为(0.867±0.032) mg/mL,而乙酸乙酯部位对α-葡萄糖苷酶的半抑制率(IC50)为(0.064±0.013) mg/mL。综上证明乙酸乙酯部位为黄花倒水莲抗氧化降血糖最有效部位。通过本实验可以初步确定该活性部位中主要活性物质为多酚类化合物,其最优的单一活性成分还需做进一步研究。