土豆中酪氨酸酶的提取及植物精油对其激活作用与动力学研究

陈怀庆,廖兴宏,赵 慧,杨俊棋,王文君,张 岩

(遵义医科大学珠海校区生物工程系,广东珠海 519041)

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1)普遍存在于生物体中,是多功能含铜氧化酶[1],可以作为酪氨酸羟化酶、多巴氧化酶,是产生黑色素的决定性酶[2],也是引起蔬果褐变的关键酶[3]。其广泛存在于动植物体内,其中土豆、蘑菇中含量尤为丰富[4],研究表明从土豆中提取酪氨酸酶,并用分光光度法测定其活性一直是简便、可行的方式[5-6]。

研究发现上调酪氨酸酶活性可以增加黑色素生成,是目前筛选白癜风治疗药物一种方法。从天然植物中寻找酪氨酸酶激活剂是目前研究的热点[7-9]。植物精油是植物体内的次生代谢产物,主要由小分子化合物组成,气味芳香易挥发。研究发现含有精油的天然药物配方对白癜风模型的动物具有治疗效果[10-11]。因此,植物精油在激活酪氨酸酶,治疗白癜风等疾病方面具有应用前景和开发潜力。但目前关于植物精油对酪氨酸酶研究多侧重在抑制作用[12-13],涉及精油类型较多如花香类、香草类、柑橘类、辛香类和土香类[14-15],多用于美白护肤。而植物精油对酪氨酸酶的激活作用的研究较少,只有佛手柑类精油[16]、茶油[17]等简单几种。而关于百里香、茶树、依兰精油在抑菌和祛痘方面研究较多[18-19]，对酪氨酸酶活性的研究未见报道。

目前针对植物精油对酪氨酸酶的激活作用研究较为缺乏的现状。本课题将研究植物精油对酪氨酸酶的活性影响,寻找天然酪氨酸酶激活剂,为白癜风的治疗奠定基础。研究内容主要有:优化土豆中酪氨酸酶提取工艺与反应条件;采用多巴速率氧化法评价植物精油对酪氨酸酶的活性影响;通过酶动力学实验研究植物精油的激活机理。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜土豆 贵州省瓮安县;L-多巴 上海麦克林生化有限责任公司;补骨脂素 陕西飞宇生物技术有限公司;橘子、尤加利、杜松、冬青、桂皮、罗勒、薄荷、欧白芷、茶树、百里香、桂花、百合、绿化白千层、依兰、佛手柑植物精油 卡根生物科技有限公司;氢氧化钠 天津市大茂化学试剂厂;磷酸氢二钾 汕头市光华化学试剂有限公司;磷酸二氢钾 天津市大茂化学试剂厂;二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide DMSO) 天津市大茂化学试剂厂;其余试剂 均为分析纯。

UV6200紫外分光光度计 日本岛津公司;JP-1500B粉碎机 永康市久品工贸有限公司;Centrifuge 5424R高速冷冻离心机 德国艾本德公司;KQ-300DE超声仪 昆明市超声仪器有限公司;DLSB-10L/20旋转蒸发器 巩义市予华仪器有限责任公司;SHHW21.600AⅡ三用电热恒温水箱水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 土豆中酪氨酸粗酶的提取条件的确定 取新鲜土豆去皮切成1 cm×1 cm×1 cm块状,放置于封口袋中,-20 ℃冷冻,备用[20]。取冷冻土豆10 g,粉碎机粉碎过60目筛后按照料液比1∶10 (W/V)加入磷酸盐缓冲液(50 mmoL/L,pH6.8),4 ℃冷冻离心机4000 r/min离心10 min,上清液即为粗酶。

1.2.1.1 磷酸盐缓冲液pH的确定 固定料液比为1∶10 (W/V),测定各磷酸盐缓冲液pH5.8、6.3、6.8、7.3、7.8下酪氨酸酶活力。

1.2.1.2 料液比的确定 磷酸盐缓冲液pH由1.2.1确定,测定各冷冻土豆与缓冲液的料液比(W/V):1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12下酪氨酸酶活力。

1.2.2 酪氨酸粗酶的反应条件的确定 将3.5 mmoL/L的L-多巴1.0 mL、磷酸缓冲液(50 mmoL/L,pH6.8)2.0 mL于试管中35 ℃恒温预热5 min,后加入1.0 mL粗酶混匀,反应一段时间后,用紫外分光光度计测定475 nm处的吸光度[21-22]。每个样品做三组,每组测三次,取均值。每分钟多巴色素在475 nm波长吸光度增加0.001为一个酶活力单位,即1 U·min-1。

1.2.2.1 反应时间的确定 反应温度35 ℃,底物L-多巴/粗酶加入量5∶5,测定反应时间:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19 min 下酶活力的变化。

1.3.2 反应温度的确定 反应时间由1.3.1确定,底物L-多巴/粗酶加入量5∶5,测定各反应温度:25、30、35、40、45 ℃下酶活力的变化。

1.2.2.3 底物L-多巴/粗酶加入量的确定 反应时间由1.2.2.1确定,反应温度由1.2.2.2确定,测定各底物L-多巴/粗酶加入量:1∶5、2∶5、3∶5、4∶5、5∶5、6∶5、7∶5下酶活力的变化。

1.2.3 天然植物精油对酪氨酸酶活性影响

1.2.3.1 最优天然植物精油的筛选 采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法,稍作修改[23]。按表1分别加入橘子、尤加利、杜松、冬青、桂皮、罗勒、薄荷、欧白芷、茶树、百里香、桂花、百合、绿化白千层、依兰、佛手柑植物精油(C=0.4 mg/mL)、L-多巴溶液(3.5 mmoL/L)、PBS(50 mmoL/L,pH6.8)及DMSO后混匀,35 ℃恒温预热5 min,加入按1.2.1条件下提取酪氨酸粗酶,于35 ℃水浴反应15 min,于475 nm处测定吸光度。每个样品做三组,每组测三次,取均值,计算激活率。

表1 反应液的组成(mL)Table 1 Composition of the reaction solution(mL)

式中:A、B、C、D表示实验中四只试管的吸光度值。

1.2.3.2 三种植物精油对酪氨酸酶的激活作用 将筛选出来的百里香、茶树、依兰精油与阳性对照补骨脂素分别配制成浓度为0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg/mL的溶液,按表1分别加入植物精油或补骨脂素、L-多巴溶液(3.5 mmoL/L)、PBS(50 mmoL/L,pH6.8)及DMSO后混匀,35 ℃恒温预热5 min,加入按1.2.1.2条件下提取酪氨酸粗酶,于35 ℃水浴反应15 min,于475 nm处测定吸光度。每个样品做三组,每组测三次,取均值,计算各浓度下激活率(同1.2.3.1)。

1.2.4 酶动力学实验 固定酪氨酸酶的添加量,选择不同浓度(0、1.5、3.0 mg/mL)植物精油,进行动力学实验[24]。 按表2分别加入3.5 mmoL/L L-多巴溶液、PBS(50 mmoL/L,pH6.8)并与不同浓度植物精油(0、1.5、3.0 mg/mL)混匀后,35 ℃预热5 min,再加酪氨酸酶在35 ℃反应15 min,于475 nm处测定吸光度,通过Lineweaver-Burk图测定激活类型,以上测试均有两个以上的单独试验并各重复3次。

表2 酶的动力学实验反应液组成(mL)Table 2 The reaction liquid composition of enzyme kinetics experiment(mL)

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 土豆中酪氨酸粗酶的提取条件的确定

2.1.1 磷酸盐缓冲液pH的确定 如图1所示,酪氨酸酶活性先减少后增加再减少,酪氨酸酶在pH为6.8时酪氨酸酶活性最高,随着pH的继续增高,酶活性大幅度降低,在pH为7.8时酶活性几乎丧失。pH是影响酶活性较为常见的因素,研究表明植物蛋白酶最适pH为3～10,大多数植物酶的最适pH在7左右偏酸性[25],实验结果也显示磷酸缓冲液在pH为6.8最为合适。

图1 pH对酪氨酸酶活性的影响Fig.1 Effect of pH on the activity of tyrosinase注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05),图2～图5同。

2.1.2 料液比的确定 如图2所示,冷冻土豆与缓冲液的料液比对酶活性影响为随着料液比的增加,酶活力呈现先增加后减少的趋势,当料液比在1∶10时,酶活力达到最大值,继续改变料液比酶活力仍会出现增大的现象,但考虑实际情况,料液比在1∶10最合适。

图2 料液比对酪氨酸酶活性的影响Fig.2 Effect of material to liquid ratio of tyrosinase activity

2.2 酪氨酸粗酶的反应条件的确定

2.2.1 反应时间的确定 如图3所示,酪氨酸酶最适反应时间13 min,在此之前酶活力不断增加,之后酶活力趋于稳定。因为当反应13 min左右以后,L-多巴底物与酪氨酸酶几乎反应完全,不再随时间的增加继续反应,与文献报道反应时间一致[15,26]。

图3 反应时间对酪氨酸酶活性的影响Fig.3 Effect of reaction time on the activity of tyrosinase

2.2.2 反应温度的确定 如图4所示,在25～45 ℃反应条件对酶活力影响较小,但当温度低于35 ℃随温度的增加酶活力增大,高于35 ℃以后不断减小,酪氨酸酶最适反应温度为35 ℃,且超过45 ℃酶可能会失活[27],因此酪氨酸酶最适反应温度为35 ℃。

图4 反应温度对酪氨酸酶活性的影响Fig.4 Effect of reaction temperature on the activity of tyrosinase

2.2.3 底物L-多巴/粗酶加入量的确定 如图5所示,随着底物L-多巴加入量/粗酶加入量比例的增大,酪氨酸酶活性逐渐上升,当比例为5∶5时,所测酪氨酸酶活力最大即酪氨酸酶活力峰值,当比例继续增大时,酶活性开始下降,从节约成本和高效的角度考虑底物L-多巴加入量/粗酶加入量5∶5最合适。

图5 底物L-多巴/粗酶加入量对酪氨酸酶活性的影响Fig.5 Effect of substrate L-dopa/amount of crude enzyme tyrosinase activity

综上可知,土豆中酪氨酸酶的提取条件为磷酸盐缓冲液pH6.8、冷冻土豆与缓冲液的料液比1∶10 (g/mL)、反应条件为反应温度35 ℃、反应时间13 min、底物L-多巴加入量/粗酶加入量5∶5。

2.3 15种植物精油对酪氨酸酶活性影响

2.3.1 最优天然植物精油的筛选 筛选了15种天然植物精油(C=0.4 mg/mL)对酪氨酸酶活性的影响,结果如表3所示。结果显示,植物精油可影响酪氨酸酶的活性,编号1～7各精油有抑制作用,编号8～15各精油有激活作用,百里香、茶树、依兰精油对酪氨酸酶有显著的激活作用(P<0.05),因此将对其激活机理进一步研究。

表3 15种天然植物精油对酪氨酸酶活性的影响Table 3 Effect of fifteen natural plant essential oils on tyrosinase activity

2.3.2 三种植物精油对酪氨酸酶的激活作用 由图6可知,百里香、茶树、依兰精油对酪氨酸酶有明显的激活作用,且呈浓度依赖关系。表4可知,三种精油的IC50值分别为0.488、0.429、0.480 mg/mL,略低于阳性对照补骨脂素(IC50=0.328 mg/mL)。

表4 植物精油对酪氨酸酶的激活作用Table 4 Activation of tyrosinase by plant essential oils

图6 三种植物精油对酪氨酸酶的激活作用Fig.6 Activation of tyrosinase by three plant essential oils

2.4 百里香、茶树、依兰精油对酪氨酸酶的动力学分析

为了进一步研究百里香、茶树、依兰精油对酪氨酸酶的激活机制,测试了三种不同浓度精油的Lineweaver-Burk双倒数曲线。补骨脂素是一种常见的酪氨酸酶激活剂,为本实验阳性对照。如图7所示,随着百里香精油的浓度不断增大,Km(米氏常数)不变,Vmax(最大反应速度)逐渐减小,根据Saboury[28]对于激活类型的判断,百里香精油为非竞争型激活,表明底物L-多巴和激活剂与酶同时结合,两者没有竞争作用[12]。

图7 百里香精油对酪氨酸酶激活作用的动力学双倒数曲线Fig.7 Lineweaver-Burk of tyrosinase activation by thyme oil

如图8、图9所示,茶树、依兰精油的三条直线相交于第二项限,随着精油浓度增加,Km逐渐减小,Vmax不断变小,可判断这两种精油为混合型激活,即竞争性激活与非竞争激活同时存在,表明底物L-多巴和激活剂与酶同时结合,激活剂与底物L-多巴竞争酶的结合位点[29]。

图8 茶树精油对酪氨酸酶激活作用的动力学双倒数曲线Fig.8 Lineweaver-Burk of tyrosinase activation by tea tree oil

图9 依兰精油对酪氨酸酶激活作用的动力学双倒数曲线Fig.9 Lineweaver-Burk of tyrosinase activation by ylang-ylang oil

如图10所示,补骨脂素相交于第三项限,随着补骨脂素浓度增加,Km逐渐减小,Vmax不断变小,可判断其为混合型激活。相比于阳性对照,三种植物精油对酪氨酸激活略弱,但植物精油含有疏水性化合物,对皮肤具有更高的亲和力[30],这对于化妆品或食品工业可能是重要的,但是还需要深入的研究这三种植物精油的组成成分。

图10 补骨脂素对酪氨酸酶激活作用的动力学双倒数曲线Fig.10 Lineweaver-Burk of tyrosinase activation by psoralen

3 结论

从新鲜土豆中提取酪氨酸酶,以L-多巴为底物进行单因素分析,确定了酪氨酸酶最适提取条件为磷酸盐缓冲液pH6.8、冷冻土豆与缓冲液的料液比1∶10 (g/mL)。酪氨酸粗酶的反应条件单因素优化中确定了最适反应温度35 ℃、反应时间13 min、底物L-多巴加入量/粗酶加入量5∶5。

筛选了15种植物精油对酪氨酸酶活性影响,发现百里香、茶树、依兰精油对酪氨酸酶有显著的激活作用,IC50值分别为0.488、0.429、0.480 mg/mL,接近阳性对照补骨脂素0.328 mg/mL。动力学实验证明百里香精油为非竞争型激活作用,茶树、依兰精油为混合型激活作用。

本实验证明百里香、茶树、依兰精油对酪氨酸酶有较好的激活作用,为新型安全的酪氨酸酶激活剂的开发利用打下基础,也为植物精油的进一步利用提供实验依据。后期将在以下几个方面进一步研究:植物精油是由小分子组成的混合物,化学成分较为复杂,哪些成分对精油的激活作用起关键作用,及各成分之间是否有协同或是拮抗作用,需要进一步研究。本实验只是对精油激活酪氨酸酶的活性及动力学方面做了研究,若用于治疗疾病,还需要进行细胞及动物实验等药理方面的研究,进一步考察植物精油的有效性和安全性。