生物炭复合青霉菌修复砷污染土壤对其微生物群落功能多样性的影响

2020-05-01段靖禹周长志吴志豪马学文

环境科学研究 2020年4期

段靖禹，周长志，曹柳，吴志豪，侯红*，马学文

1.中国环境科学研究院，环境基准与风险评估国家重点实验室，北京 100012 2.山西大学环境科学研究所，山西太原 030032 3.济源市环境科学研究所，河南济源 454650

砷(As)是一种类金属元素，广泛存在于地壳表面[1].土壤中砷的来源是多方面的，有自然源与人为源，地质岩石中的砷决定了砷的地域平均丰度，不同类型的岩石矿物决定了不同母质发育土壤的含砷量，在自然本底值的基础上，大量含砷矿物的开采以及含砷农药的使用，增加了土壤砷的含量，甚至在我国多个地域造成了严重的危害[2].砷污染土壤的治理已成为环境科学领域关注的焦点问题之一[3].自1975年以来，已形成了多项砷污染土壤修复技术，整体分为土壤污染物总量消减技术与土壤污染物稳定化技术，其中，土壤污染物总量消减技术主要包括客土换土技术[4]、超积累植物提取技术[5]、化学淋洗技术[6]，稳定化技术主要包括无机钝化技术[7]、有机钝化技术[8]、生物钝化技术[9].大部分砷污染土壤修复技术已经应用于实际案例中，但是客土换土技术的高额费用、超积累植物的适用地域问题、化学淋洗使用不当的二次污染、钝化剂稳定性的长期与否等问题，都在一定程度上影响着土壤砷污染修复效果，而微生物修复作为一种环境友好型的治理技术有着较好的发展前景.

土壤中的微生物作为土壤生态系统中最为主要的环节[10]，土壤生态系统的各种活动都有微生物的参与，微生物被视为土壤条件转化的驱动因子[11]，微生物在土壤中的分布及其功能多样性与环境之间存在互相影响的关系[12].土壤环境中的碳源分布决定了微生物的种类与分布，微生物的代谢活动产物决定了土壤的肥力条件和营养结构[13]，同时微生物在重金属胁迫下的反应比植物敏锐得多[14]，因此，土壤微生物群落功能多样性也是土壤环境生态系统优劣的一个评价标准.目前微生物群落多样性研究的方法主要有Biolog、16s rRNA基因测序等，后者通过基因测序，能够得到土壤中微生物的具体种类及其丰度，但无法得到微生物的具体能量来源.在目前的微生物研究中，相比于传统的菌种分离鉴研究方法，Biolog法能够更快、更便捷、更有效地反映出微生物群落结构功能的信息[15].Garland等[16]最先将Biolog ECO微平板运用于微生物群落结构特征的研究，这项工作上的创新引来了一系列的关注.多年来，Biolog法已成为研究微生物功能多样性的重要工具.Biolog法在土壤微生物群落功能多样性的研究中应用最为广泛，其中涉及各种不同类型天然土壤、不同土地利用类型土壤、退化土壤、受污染土壤以及湿地土壤等，所得微生物功能多样性特征与土壤基本特征都能建立较好的联系[17].

多数研究表明，Penicilliumsp.菌属在砷污染土壤的修复中有着极大的潜力[18]，辅以一定的生物炭，加强生物刺激[19]，或许会有更好的修复效果.鉴于此，该文在青霉菌复合生物炭修复砷污染土壤的同时，采用Biolog法通过AWCD(Biolog微平板孔中溶液吸光值平均颜色变化率)、Shannon-Wiener指数、Simpson指数、均匀度指数探究不同处理下砷污染土壤中微生物群落功能多样性，以此得出生物炭与青霉菌在改善砷污染土壤的同时，对土壤中微生物群落功能多样性的影响；并通过Biolog法对31种碳源做详细分析，得出青霉菌的优势碳源种类，在实际修复过程中通过控制碳源种类来控制青霉菌的数量分布，能够根据微生物的优势碳源种类设计更好的处理方法，以期为砷污染土壤修复提供参考.

1 材料与方法

1.1 试验概况及试验设计

供试土样为山西省古交市矿区土，土壤的基本理化性质：w(TN)为0.35 g/kg；w(有机质)为1.256 g/kg；w(TP)为585.52 mg/kg；w(TK)为14.70 g/kg；w(碱解氮)为14.92 mg/kg；w(有效磷)为4.64 mg/kg；w(速效钾)为89.1 mg/kg；EC为100.3 μS/cm；w(TAs)为10.67 mg/kg.通过外源砷的添加，进行土壤老化，最终得到w(TAs)为20 mg/kg、有效砷含量为17.74 mg/kg的供试土壤，土壤老化完成后，取27个花盆，各花盆内准确称量300 g老化土壤.

试验采用3×3完全随机区组设计(见表1)，包括3个菌剂接菌量(质量比)，分别为T1(0%)、T2(10%)、T3(20%)，每个接菌量下3个生物炭添加量(质量比)，分别为B1(0%)、B2(2%)、B3(4%).共9个处理，每组处理3个重复.

表1 完全随机区组试验设计Table 1 Completely randomized block test design

1.2 供试菌种

试验用青霉菌购自北京百欧博伟生物技术有限公司，编号bio-65577.将培养好后带有青霉菌的液体培养基按试验设计依次接种到花盆中.接菌时应注意菌种与土壤充分混匀，后置于28 ℃恒温培养箱中培育.

1.3 土壤中有效砷含量测定

准确称取 0.400 0 g土样，放入50 mL离心管中，加入20 mL浸取剂(1 mol/L H3PO4与0.1 mol/L抗坏血酸的混合液)，摇匀并在回旋式振荡器上以180 r/min的转速振荡浸提一定时间，之后放入100 ℃的恒温水浴锅内水浴3 h，然后将离心管放入离心机中，4 000 r/min下离心5 min，过滤得到试液，通过原子荧光法测定有效砷的含量.

1.4 土壤微生物功能多样性分析

称取培养第45天时各处理中10.0 g新鲜土样，置于装有90 mL已灭菌生理盐水(0.85%的NaCl)的锥形瓶内，200 r/min下振荡30 min，加入少量玻璃珠，以使土壤中的菌充分释放，静置10 min后用生理盐水(0.85%的NaCl)稀释 1 000 倍，将稀释好的土壤悬浊液150 μL接种到Biolog-Eco板(BIOLOG,Microstation,USA)微孔中，接种后的Biolog-Eco板在25 ℃下培养1周.每隔24 h用Biolog Reader仪(BIOLOG,Hayward,USA)测定波长在590和750 nm处的吸光值[20].

微平板孔中溶液吸光值平均颜色变化率(AWCD)用来描述土壤微生物的代谢活性，计算公式：

(1)

式中：Ri为培养基第i孔的吸光值；R0为对照孔的吸光值；n为培养基孔数，Biolog-Eco微平板的n值为31.

Shannon-Wiener多样性指数(H)用于评估物种丰富度，计算公式：

(2)

式中，Pi为培养基第i孔的相对吸光值与整个微平板相对吸光值总和的比值.

均匀度指数(E)，计算公式：

E=H/lnS

(3)

式中，S为颜色变化的培养基孔数.

Simpson优势度指数(D)用于评估最常见种的优势度，计算公式：

(4)

不同碳源的利用特征分析，用来评价微生物的优势碳源种类.利用每个碳源(见表2)微孔的平均颜色变化率(AWCD)的数值来评价微生物对各碳源的利用能力及特征.

1.5 统计分析

每隔24 h测得的吸光值用Excel 2007软件记录并整理，碳源动态利用特征采用各处理不同时段的AWCD平均值分析，土壤微生物群落功能多样性指数及土壤微生物特征碳源的利用分析均采用培养168 h的数据计算，运用SPSS 20.0软件做方差分析、主成分分析[21-22]，运用Excel 2007、Origin 9与R语言软件绘图.

表2 31种碳源的分类、编码及名称Table 2 Classification,coding and name of 31 carbon sources

2 结果与分析

2.1 不同处理下土壤中有效砷的含量

注：不同小写字母表示各处理之间在0.05水平存在显著性差异(n=3).下同.图1 不同处理土壤中有效砷含量的变化Fig.1 Changes of available arsenic content in soil of different treatments

青霉菌复合生物炭在砷修复治理中有显著的交互作用.由图1可见：青霉菌与生物炭的添加会使土壤中有效砷含量发生变化，T1B1(CK)处理中的有效砷含量基本保持不变，其余处理有效砷含量均有不同幅度的下降.T1B1、T1B2、T1B3、T2B1处理之间差异较大(P<0.05)，有效砷含量下降幅度大；T2B3、T3B1、T3B2、T3B3处理之间差异很小，有效砷含量下降幅度较小.与未经任何处理的T1B1相比，钝化效果最好的处理为T3B3，有效砷含量由17.74 mg/kg降至12.69 mg/kg，钝化率为27.6%.

2.2 砷污染土壤中微生物利用碳源的动态特征

不同时间阶段的AWCD值可以用来表示微生物平均活性的变化，能直观地体现微生物群落的生长速度和能够达到的最终反应程度，细胞死亡阶段无法观测到样品的AWCD值.通过SPSS 20.0软件对多个时间点的AWCD平均值做双因素方差分析，结果如图2所示，随着培养时间的增加，不同处理组的AWCD值均呈上升的趋势.前24 h内，各处理组的AWCD值均很低，处理之间无显著性差异；24 h后，除T1B1处理之外，其余处理组的AWCD值均显著升高.

由图2可见：T1组的3个处理中，T1B1处理的AWCD值在整个培养时期均显著低于T1B2、T1B3处理，T1B3处理在各时间段的AWCD值均低于T1B2处理，但不存在显著性差异(p>0.05)；添加10%青霉菌(T2)的3个处理中，T2B1与T2B2随培养时间的变化，AWCD值均呈上升趋势，且二者之间没有显著性差异，T2B3处理的AWCD值在培养72 h之前显著低于T2B1、T2B2处理，但培养96 h之后，3个处理的AWCD值之间无显著性差异；添加20%青霉菌(T3)的3个处理中，T3B2处理的AWCD值显著高于T3B1、T3B3处理.B1组的3个处理中，T2B1与T3B1在整个培养时间内的AWCD值均显著高于T1B1，T2B1、T3B1处理的AWCD值在培养时间内没有显著性差异；B2组、B3组与B1组的情形相似.

图2 不同处理下土壤微生物利用碳源的动态特征Fig.2 Dynamic characteristics of soil microbial utilization carbon source under different treatments

2.3 砷污染土壤中微生物对不同碳源的利用特征

2.3.1生物炭对砷污染土壤中微生物碳源利用特征的影响

由图3可见：在T1B1处理中，甘氨酰-L-谷氨酸(由植物根系分泌)的AWCD值最高，但也仅为0.037;其余碳源的AWCD值均不超过0.020，大部分为0.001.由此可以看出，在有效砷含量较高(17.74 mg/kg)的土壤中，大部分微生物被灭活，仅有少数与植物根系有密切关系的微生物存活.T1B2处理中加入了2%的生物炭，50%碳源的AWCD值有显著的上升，D-纤维二糖的AWCD值达1.500，其余均在0.500以上.生物炭加入土壤后，对环境中的有效砷产生一定的吸附钝化作用，有效砷含量(16.90 mg/kg)下降使得部分微生物重新开始了生命活动，此时土壤中微生物能够利用的碳源大多数为单糖类及其及衍生物、二糖底物、多糖底物，少数为脂类、氨基酸以及其代谢中间产物.T1B3处理中加入了4%的生物炭，相比于T1B2处理，只有N-乙酰基-D-葡萄胺、a-D-乳糖两种碳源的AWCD值上升，AWCD值整体呈下降的趋势.

2.3.2砷污染土壤中青霉菌对碳源的利用特征

由图3可见，T2B1处理中加入了10%的青霉菌，与T1B1处理对比可见，青霉菌在砷污染土壤中的活性很高，几乎对所有的碳源都有一定的吸收，但a-环状糊精、肝糖这两种碳源的AWCD值几乎为零.青霉菌对D,L-a-甘油、2-羟苯甲酸、a-丁酮酸、L-苏氨酸这4种碳源的利用率极低，AWCD值均<0.5.青霉菌对氨基酸类中大部分碳源以及脂类碳源的AWCD值均高于1.0，对糖类、酚酸类代谢能力稍弱一些，AWCD值在0.3～1.0之间.

T2B2处理中添加了2%的生物炭，青霉菌优势碳源的AWCD值均下降，但相较于T2B1处理，AWCD平均值上升；T2B3处理中，所有碳源的AWCD值均下降.

接菌量为T3的三组处理改变了菌种浓度，由10%提高为20%，结果显示无论是整体AWCD值，还是各碳源的利用率均与10%菌种浓度结果相似，因此该研究不再做过多的分析.

2.4 土壤微生物对碳源利用多样性的PCA分析

为进一步了解不同处理下微生物群落功能的差异，选用培育168 h的微生物对31种碳源的AWCD值做PCA分析，对数据提取2个主成分，并将不同处理在2个主成分上的得分值以PC1、PC2为横纵坐标作图，以表征土壤微生物的代谢特征.由图4可见：仅有T1B1位于PC1的负方向上，表明T1B1处理中的土壤微生物对碳源的利用模式与其余处理均有极大的差异；T1B2、T1B3处理分别位于PC1轴的正方向与PC2轴的正方向，可见这两个处理中微生物对碳源的利用模式较为相似；其余处理在图中分布比较集中，几乎全部位于PC1轴正方向与PC2轴负方向上，由此得出这几种处理对碳源的利用模式没有差异，只是对碳源的利用能力上有稍有不同.

图5 土壤微生物多样性指数Fig.5 Functional diversity indices of soil microbial communities

图3 砷污染土壤中微生物对不同碳源的利用特征Fig.3 Microbial use of different carbon sources in arsenic-contaminated soil

图4 不同处理下碳源利用主成分分析Fig.4 Principal component analysis of carbon source utilization under different treatments

2.5 不同处理下土壤中可培养微生物多样性指数

由图5可见：随着青霉菌接菌量与生物炭施用量的变化，Shannon-Wiener指数(H)与均匀度指数(E)的变化趋势高度一致.在相同的菌种梯度下，随着生物炭含量的增加，Shannon-Wiener指数(H)与均匀度指数(E)均呈小幅先升后降的趋势.在相同生物炭梯度下，当青霉菌含量由0增至10%时，Shannon-Wiener指数(H)与均匀度指数(E)呈跳跃式上升;当青霉菌含量由10%加至20%时，二者出现略微的下降.在没有青霉菌的处理中，Simpson指数随生物炭含量的上升呈先降后升的趋势，在加入青霉菌的处理中Simpson指数均为0.05.

各指数与土壤中有效砷含量之间的相关性分析如表3所示，土壤中有效砷含量与Shannon-Wiener指数(H)、均匀度指数(E)均呈显著负相关，相关系数分别为-0.886、-0.876，与Simpson指数(D)呈显著正相关，相关系数为0.901.

表3 各指数与土壤中效砷含量相关性分析Table 3 Correlation analysis between the indexes and the available arsenic content in soil

注：*表示在0.05水平(双侧)上显著相关，**表示在0.01水平(双侧)上显著相关.

3 讨论

Biolog法拥有相对简便的操作流程，其可以通过AWCD值以及多种指数直观地反映出土壤中微生物功能多样性、物种多样性，由AWCD值演算来的Shannon-Wiener指数(H)与均匀度指数(E)[23]能够反映微生物群落的丰富度，二者值越大表明群落多样性越高.Simpson指数(D)能够反映土壤微生物群落常见种的优势度变化，数值越大表明得到同一物种的几率越大，微生物多样性越低.砷污染土壤中有效砷含量、生物炭浓度、青霉菌添加量等因素都会对土壤中微生物群落多样性以及微生物的活性产生一定的影响.武爱莲等[24-25]研究表明，生物炭的加入会导致AWCD值、土壤微生物群落功能多样性指数、碳源利用丰富度降低，与该研究结果不同.

目前许多生物炭修复重金属土壤的研究[26]表明，生物炭的添加会使得砷污染土壤的pH升高，进而引起砷的解析，激发砷的活性，增加砷的环境风险.但是生物炭在加入土壤中会作为碳库长时间的储存，丰富土壤中的碳源种类、改善土壤中营养结构[27]、增加土壤的养分含量[28]；同时生物炭有较强的阳离子交换能力，其表面丰富的含氧官能团能与土壤中的铁、锰结合，形成铁锰氧化物，对环境中的有效砷产生一定的吸附钝化作用.有效砷含量下降的同时，与有效砷含量呈显著负相关的微生物群落多样性指数与碳源利用丰度均上升(笔者将此处上升的部分定义为U)，生物炭过量添加会对微生物的活性产生抑制作用，导致土壤微生物群落多样性指数及碳源利用丰度均下降(下降的部分定义为D).低浓度生物炭添加后，U远大于D；高浓度生物炭添加后，U远小于D.直观地表现为砷污染土壤中微生物群落功能多样性、碳源利用丰富度均随着生物炭浓度的上升呈先升后降的趋势.

青霉菌加入土壤中，土壤微生物群落的AWCD值显著上升，添加少量生物炭后，青霉菌对大部分碳源的利用率下降，而整体AWCD值上升，原因有两个：①适量生物炭与青霉菌的共同作用使得土壤中有效砷含量下降[29]，其他微生物活化、土壤微生物群落多样性上升以及碳源利用丰度上升，使得整体的AWCD值上升；②多种微生物同存，在土壤中养分含量一定的条件下，青霉菌的数量会相应减少，因此青霉菌对碳源的利用能力会减弱，AWCD值下降.

青霉菌对脂类碳源及氨基酸类碳源的利用率很高，对糖类、酚酸类碳源的利用率稍弱一些，对胺类及少部分酸类碳源的利用能力最弱.青霉菌对D-半乳糖醛酸、L-天冬酰胺酸、L-丝氨酸、L-精氨酸、r-羟基丁酸这5种碳源的利用率均较高，将这5种碳源定义为青霉菌的优势碳源，而L-天冬酰胺酸、L-丝氨酸、L-精氨酸都是植物根际分泌物，由此推断青霉菌与植物复合修复砷污染土壤有一定的潜力.超积累植物既可富集土壤中的砷，也可分泌促进青霉菌生长发育的优势碳源，在二者的共同作用下，土壤中有效砷含量可能会发生显著的下降；青霉菌还可以添加到某些对砷有累积性的农作物的根际土壤中，在植物根部吸收土壤中砷的时候，先一步将有效砷钝化，从而减少作物对砷的累积量.