极光激酶A 抑制剂MLN8237 对宫颈鳞状细胞癌细胞顺铂化疗敏感性的影响

马玉花，张泽高，马苗苗，热伊拉·麦买提伊敏，开丽曼·阿不都巴热，杨杰，祁小丽

宫颈癌是世界女性第二大恶性肿瘤，也是第二大最常见恶性肿瘤死亡原因［1］。发展中国家宫颈癌晚期病例更常见，包括ⅠB2～ⅣA期［2］。顺铂对晚期宫颈癌化疗有效，但容易产生耐药，且耐药的机制尚未定论［3］。极光激酶A（Aurora A）在细胞周期进展的调节中起关键作用，是体内肿瘤形成的必需条件［4］。有报道Aurora A抑制剂MLN8237在顺铂（DDP）耐药的胃癌细胞系中可逆转其耐药性［5］，但在宫颈癌中尚缺乏相关研究。本研究自2017年11月至2018年11月探讨极光激酶A抑制剂与顺铂在体外宫颈癌细胞系联合应用的效果，为临床应用提供依据。

1 资料与方法

1.1 主要试剂与药品 兔抗人P（T288）-Aurora A多克隆抗体购自美国Abcam 公司，兔抗人P53（9282）抗体购自美国Cell Signaling Technology 公司，兔抗人P（S315）-P53（2528）抗体购自美国Cell Signaling Technology 公司，兔抗人P21WAP1/cip1（2947）抗体购自美国Cell Signaling Technology 公司。碱性磷酸酶标记的IgG羊抗兔二抗购自北京钟彬中桥生物公司，顺铂购自中国齐鲁制药有限公司，MLN8237 购自美国Selleck 公司，细胞凋亡（556547）检测试剂盒购自美国BD公司。

1.2 细胞系 宫颈鳞状细胞癌HCC94 细胞系购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 细胞培养 细胞贴壁生长在25 cm2培养瓶中，加入100 U/mL 青霉素、100 U/mL 链霉素及10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基，置于37 ℃、二氧化碳体积分数5%及饱和湿度的培养箱中培养，每2～3天传代一次。

1.3.2 四唑盐（MTT）法检测 MLN8237 对细胞增殖能力的影响取对数生长期HCC94细胞，细胞密度为5×104/mL，于前一天下午接种于96 孔培养板，每孔100µL，置于37 ℃、二氧化碳体积分数为5%、饱和湿度的培养箱中培养过夜。至细胞单层铺满孔底，加入浓度梯度的药物，次日上午加药，每孔100µL。设6～7 个梯度，5 个复孔。以终浓度MLN8237 为5、10、20、40、80 和160µmol/L，DDP 2.5、5、10、20、40、80 和160µmol/L 加入药物。对照孔加入相同浓度的药物溶解介质二甲基亚砜（DMSO）。另设只加培养液的调零孔。联合作用组以小剂量进行联合作用，同时加入联合作用药物。药物浓度分别以MLN8237 为5、10、20 µmol/L，DDP 2.5、5、10、20µmol/L。分别在给药24 h 和48 h 后每孔加入5 g/L MTT20µL，继续培养4～6 h，吸弃培养液加入DMSO 150µL，振荡15 min，酶标仪570 nm波长，比色测定OD值。实验重复3次。计算肿瘤细胞存活率（%）：＝（实验组OD值-调零孔OD值/对照组OD值-调零组OD值）×100%。

1.3.3 流式细胞术检测 MLN8237 联合顺铂对HCC94 细胞凋亡的影响MLN8237（终浓度2 µmol/L）、顺铂（终浓度1µmol/L），分别单独作用和联合作用48 h，收获细胞，制成单细胞悬液，分别按细胞凋亡试剂盒说明书操作，实验重复3 次。结果分析采用ModFit软件。

1.3.4 Western 印迹方法 用MLN8237（终浓度2 µmol/L），顺铂（终浓度1 µmol/L）和MLN8237（2µmol/L）加顺铂（终浓度1µmol/L）培养HCC94细胞（5×106/mL）48 h 收获细胞。按说明书提取蛋白，进行定量，取25µg蛋白上样。10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，12%分离胶，转印到PVDF 膜，将膜移至含有QuickBlockTMWestern 封闭液的平皿中，室温封闭20 min。适当浓度一抗孵育4 ℃过夜，辣根过氧化酶羊抗兔二抗孵育1～2 h，Western 洗涤液洗涤，ECL 显色液显色，放入BIO-RAD 凝胶成像分析系统，得到印迹图像。

1.4 统计学方法 实验重复3 次，收集数据，取平均值。采用SPSS 19.0 软件进行数据分析。药物相互作用分析采用两因素多水平析因设计，统计分析采用析因设计方差分析；计量资料以x¯±s 表示，采用t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MLN8237处理后细胞形态变化 采用倒置显微镜观察，传代细胞接种过夜后，贴壁良好，1～2 d后进入对数生长期，3～4 d后贴满瓶壁，各组细胞培养基均清亮。对照组细胞生长密集，贴壁良好，表面清晰，大小一致，折光度均一，细胞呈椭圆形，细胞界限清晰，核仁多，胞质丰富。各加药组细胞增殖明显变慢，集落形成减少，密度均较对照组为低，MLN8237作用组细胞体积逐渐增大，出现较多空泡，细胞内颗粒增多，折光率降低，部分细胞变圆脱落，漂浮细胞增多，细胞间出现间隙，细胞形态改变，随药物浓度增高，作用时间延长更加明显（图1）。

图1 宫颈鳞状细胞癌细胞（HCC94）：A、B为对照组低倍镜（×100）和高倍镜（×400）下；C、D为MLN8237处理24 h后低倍镜（×100）和高倍镜（×400）下；E、F为MLN8237处理48 h后低倍镜（×100）和高倍镜（×400）下

2.2 顺铂、MLN8237及两者联合对HCC94细胞生长的影响 MTT 法检测结果显示，顺铂、MLN8237≥10 µmol/L 时均明显抑制HCC94 细胞的生长，且随药物浓度加大和作用时间延长，抑制作用都得到加强（图2）。

图2 顺铂（A）和MLN8237（B）对HCC94细胞生长的抑制

2.3 MLN8237和顺铂不同浓度联合应用对HCC94细胞增殖的影响 选择具有抑制作用，但单独作用不明显的MLN8237 浓度5、10 和20 µmol/L，顺铂2.5、5、10 和20µmol/L，时间点24 h 用于后续实验。多因素方差分析显示，顺铂不同剂量抑制HCC94细胞增殖效果不同（F＝393.11，P＜0.01），MLN8237不同剂量抑制HCC94 细胞增殖效果不同（F＝335.85，P＜0.01），顺铂和MLN8237有交互作用（F＝7.99，P＜0.01）。顺铂20µmol/L 和MLN8237 20µmol/L 联合作用，对HCC94 细胞增殖抑制效果最好。两两比较，均差异有统计学意义（均P＜0.01），见表1，图3。

表1 MLN8237和顺铂不同浓度联合应用对HCC94细胞增殖的影响/（%，）

表1 MLN8237和顺铂不同浓度联合应用对HCC94细胞增殖的影响/（%，）

顺铂MLN8237 0µmol/L 2.5µmol/L 5µmol/L 10µmol/L 20µmol/L 0µmol/L 100.00±0.00 95.54±1.35 91.93±1.84 85.73±2.55 52.16±4.68 5µmol/L 94.74±2.21 85.26±3.51 67.43±4.23 54.62±3.26 41.97±5.21 10µmol/L 86.59±1.25 78.65±2.36 59.65±4.53 42.32±3.96 29.65±5.18 20µmol/L 65.48±2.53 56.84±2.54 48.46±3.87 36.62±4.53 19.26±5.26

图3 顺铂和MLN8237联合作用对HCC94细胞生长的抑制作用

2.4 流式细胞术检测顺铂、MLN8237 处理后细胞凋亡的变化 MLN8237 处理组凋亡率较对照组显著增高，早期凋亡为主，少量晚期凋亡；顺铂组早期凋亡率较对照组有增高，主要为早期凋亡；联合组早期、晚期凋亡率均较各单药组加强，均差异有统计学意义（均P＜0.05），见表2，图4。

表2 不同药物处理48 h后HCC94细胞凋亡情况/

表2 不同药物处理48 h后HCC94细胞凋亡情况/

注：与对照组比较，aP＜0.05；与各单药组比较，bP＜0.05，DDP为顺铂

晚期凋亡0.08±0.07 4.45±1.27a 0.41±0.34a 11.94±3.76ab组别对照组MLN8237 DDP MLN8237+DDP早期凋亡0.04±0.02 20.42±4.68a 12.61±3.42a 36.52±4.82ab

2.5 蛋白印迹结果 MLN8237 处理组P21wap1/Cip1和P53表达较对照组显著增高，P（S315）-P53和P（T288）-Aurora A 表达显著降低，Aurora A 表达不改变。顺铂组P21wap1/Cip1和P53表达较对照组轻微增高，P（S315）-P53 表达轻微降低，Aurora A 和P（T288）-Aurora A 蛋白表达不改变。联合组对以上各种蛋白的影响作用较各单药组加强（图5）。

图5 不同药物处理HCC94细胞48 h后蛋白表达变化情况

3 讨论

虽然为了提高宫颈癌患者的预后，目前有很多治疗方法在不断探索中［6-7］。但最新NCCN 指南仍推荐，以DPP为基础的同期放化疗为目前中晚期宫颈癌的一线治疗方案。DPP也被认为是晚期和复发宫颈癌的标准化疗方案［8］。但顺铂化疗可引起消化道反应，很多患者不能耐受；且顺铂化疗抗拒也影响了治疗效果，使顺铂使用受到极大限制。因此，在提高早期检出率的同时，有必要筛选有效的治疗靶点，并在不增加顺铂化疗药物剂量或不良反应的前提下提高疗效。

图4 不同药物处理48 h后HCC94细胞的凋亡情况

人体细胞通过有丝分裂进行增殖分化，有丝分裂进展准确，对于维持染色体稳定性至关重要［9］。通过及时准确调节多种激酶活性，才可确保有丝分裂顺利进展。丝氨酸/苏氨酸激酶Aurora A 表达或功能异常，都会导致遗传物质分配紊乱，出现非整倍体［10］。不稳定非整倍体形成，是肿瘤的成因。有研究发现，头颈部鳞状细胞癌中Aurora A 高表达患者预后差，减少其表达，可抑制细胞增殖和增加凋亡［11］；增加其表达，可促进肿瘤增殖［10］。Aurora-A 抑制剂MLN8237 是抗肿瘤治疗的有效策略［12］，Ⅰ期、Ⅱ期临床试验显示，其效果及安全性良好，目前已进入Ⅲ期临床试验。我们前期研究已证实极光激酶可预测宫颈癌放疗抵抗和预后不良，其小分子抑制剂可逆转放疗抵抗［13］，以顺铂为基础的同期放化疗又是目前中晚期宫颈癌的一线治疗方案，如果极光激酶A 抑制剂对顺铂有显著化疗增敏作用，那么将为临床推广应用提供更有利的依据。

本研究采用MLN8237 联合顺铂处理HCC94 细胞，结果表明，两药低浓度联合应用，会明显抑制细胞增殖，显著提高凋亡率。蛋白印迹显示经MLN8237处理后，P53的Ser315位点磷酸化表达降低，P53表达增高。P53的Ser315位点磷酸化，可促进MDM2介导的P53降解。本研究提示Aurora A抑制剂MLN8237减少P53 的Ser315 位点磷酸化，抑制MDM2 介导的P53降解。DNA损伤后，P53蛋白水平明显升高，启动下游细胞修复机制，如P21 Waf1/Cip1蛋白表达上调，细胞周期停滞于G1期，对损伤的DNA进行修复。如修复成功，则细胞周期进入S期，失败则损伤细胞进入细胞程序性死亡，即凋亡阶段。本研究中，P21 wap1蛋白经MLN8237处理，表达明显增高，DPP处理组未见明显变化，联合组表达显著增高，与相关研究结果一致。本研究还显示，MLN8237不改变Aurora A表达，但降低P（T288）-Aurora A表达。

有研究和我们结果一致，Aurora A 是非小细胞肺癌患者中不良预后和顺铂治疗抵抗的生物标志物，并通过构建过表达和敲低表达体系，为其成为治疗靶点和逆转顺铂药物耐药提供了潜在证据［14］。Aurora A抑制剂VX680与顺铂对HepG2细胞以剂量和时间依赖性方式协同抑制增殖［15］。

综上所述，MLN8237 作为Aurora A 的小分子选择性抑制剂，不仅逆转宫颈癌放疗抵抗，而且也是一线同步化疗方案以及晚期和复发宫颈癌标准化疗方案——顺铂的良好增敏剂。本研究提供了抗宫颈癌治疗的新方法新思路，为其进一步临床推广提供了依据。