贵州白山羊脂联素基因（ADIPOQ）序列和表达分析

安清明，吴震洋，孟金柱，赵园园，樊军德，田秀珍，王 星

（1.铜仁学院，贵州 铜仁 554300；2.华珍牧业有限公司，贵州 铜仁 554300）

贵州白山羊是中国著名的地方山羊品种，主要分布在黔东南、黔东北等地区，存栏量100多万只，是发展贵州畜牧业的重要种质资源。脂联素（adiponectin，ADIPOQ）是脂肪细胞分泌的唯一与脂肪含量负相关的细胞因子，相关文献表明，ADIPOQ基因在脂肪代谢中起重要的调控作用[1]，脂联素基因由3个外显子和2个内含子组成，其主要编码的脂联素蛋白由信号肽、可变区、N-胶原蛋白三螺旋区域和C-球状区域构成，能够通过结合蛋白直接参与调解脂肪酸氧化和糖类摄取过程[2]。目前，研究发现ADIPOQ基因与人体的肥胖、胰岛素耐受性和动脉粥样硬化等疾病相关[3]，但在家畜动物研究中发现ADIPOQ基因遗传变异对家畜动物的生产性状具有一定的影响，如ADIPOQ基因变异可以影响猪的胴体性状[4]，影响牛的眼肌面积、背标厚度[5]，影响绵羊的生长速度和胴体性状等[6]。但在山羊中该基因的研究报道较少，仅发现954G/A变异可以影响山羊产羔数[7]。因此，本研究拟通过ADIPOQ基因的序列和表达分析，进一步增进贵州白山羊的遗传多样性和发育情况的了解，以期对贵州白山羊的合理利用提供一定的数据参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用的贵州白山羊血样及组织样均采自贵州省铜仁市德江县高山镇。采集的新鲜血样和组织样分别于-20℃和-80℃保存备用。

1.2 实验仪器及试剂

Bio-Rad PCR仪，Bio-Rad 凝胶成像仪，高速低温离心机，水平电泳仪，ABI实时荧光定量PCR仪，DNA提取试剂盒，反转录试剂盒，荧光定量试剂盒，PCR预混酶等。

1.3 PCR引物设计与合成

根据NCBI中绵羊ADIPOQ基因序列（NC_019458.2），利用Primer 5.0 设计特异性引物：F：GGATTCTGAACATCATTCATTC，R:CAGATGAGTTGGTGGGAGAC，用于ADIPOQ基因序列分析；设计特异性引物F：TACAAGAACGACAAGGCCCT，R：ACTTGGTCACCCTTCTCCAG用于组织特异性表达分析，其中荧光定量分析以GAPDH基因为内参基因，特异性引物为F: CTGACCTGCCGCCTGGAGAAA，R:GTAGAAGAGTGAGTGTCGCTT，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 ADIPOQ基因部分序列PCR扩增及测定

PCR反应体系：DNA样品1μl，Taq PCR预混酶11 μl，10 mmol·L-1上下游混合引物1 μl，加ddH2O至20μl。

PCR扩增程序：95℃预变性2 min，95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，34个循环，延伸5 min，4℃保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测无特异性条带后送生工生物工程（上海）测序。

1.5 遗传多样性数据处理

用MEGA5.0软件对测序结果进行分析比对，通过NCBI数据库查找相关物种序列，建立数据库，用Lasergene7.0软件对相关物种序列进行处理并建立系统发育树。

1.6 ADIPOQ基因实时荧光定量分析

采用Trizol法提取贵州白山羊各组织（心、肝、脾、肺和肾）总RNA，经反转录合成cDNA，按照说RT-qPCR说明书指导配置反应体系并设定反应程序。采用RT-qPCR方法分析ADIPOQ基因在白山羊心、肝、脾、肺和肾中的表达特异性。荧光定量试验设计3个重复，采用2-△△CT方法将数据进行均一化处理，计算相对表达量，最后利用Minitab16.0进行显著性差异分析。

图1 贵州白山羊ADIPOQ基因测序结果

2 结果

2.1 测序结果分析

已知引物扩增序列为455 bp，将检测的DNA测序经Chromas软件进行结果分析（图1），结果显示所用贵州白山羊样品测定序列波峰信号单一，无其他杂乱信号干扰，预示测序结果准确，可用于后续的序列分析。

2.2 贵州白山羊ADIPOQ基因差异性对比结果分析

利用MEGA5.0程序对本研究中测得的贵州白山羊ADIPOQ基因序列与An等[6]发现的绵羊等位基因A和B进行序列比对，发现贵州白山羊与绵羊等位基因A和B共有8处核苷酸变异，分别为c.26 C/G、c.161 C/T、c.190 C/A、c.196 C/T、c.226 C/T、c.331 C/A、c.407 C/T和c.418 G/A变异，比对结果见图2。

2.3 贵州白山羊ADIPOQ基因群体间遗传特征

从NCBI数据库中检索其它6个不同物种ADIPOQ基因与本试验检测得到的贵州白山羊核苷酸序列根据领位相连法（Neighbor-joining，NJ法）构建系统进化树（图3），结果表明，贵州白山羊与绵羊遗传距离最近，与牛和牦牛次之，而与猪、人类遗传距离较远，这一结果与这些物种在生物学上进化分类一致。

图2 贵州白山羊与绵羊ADIPOQ基因核苷酸序列比对结果

图3 不同物种ADIPOQ基因核苷酸序列构建的系统树

2.4 贵州白山羊ADIPOQ基因在不同组织中的表达分析

利用实时荧光定量PCR对贵州白山羊心、肝、脾、肺和肾组织中的ADIPOQ基因编码mRNA的相对表达量进行检测，由图4可知，ADIPOQ基因在肺组织中的表达量最高，其次是脾、心和肝，在肾中的表达量最低。

图4 贵州白山羊ADIPOQ基因编码mRNA表达分析

3 讨论

通过测序结果比对分析，虽然在贵州白山羊样本里没有发现核苷酸变异，但与绵羊不同等位基因比对发现8处核苷酸变异位点，说明贵州白山羊与绵羊物种之间存在的种间差异，也可能是贵州白山羊样品来源群体经过了世代选择，使得白山羊群体间核苷酸变异减少，但该结果也表明，白山羊与绵羊之间仍具有核苷酸变异，且这用变异差距可能会影响到贵州白山羊的生产性状，已有研究表明ADIPOQ基因核苷酸变异可以影响猪、牛和绵羊的生产性状[4-7]。本研究基于遗传距离聚类算法构建了贵州白山羊群体的聚类图，通过与不同物种之间的聚类分析，推测了物种间的适应性进化，研究发现，贵州白山羊与绵羊间的遗传距离最小，牛属次之，这与物种的进化关系一致，且它们均属于偶蹄目家畜，与其它物种间的进化距离较远。

对贵州白山羊内脏器官进行ADIPOQ基因编码mRNA表达量检测，结果表明在所检测器官中均有表达，但在肺脏中表达量最高，在肾脏中表达量最低，这与李雪梅等研究结果存在差异[8]，但与陈宇光等研究结果相似，结果均发现ADIOQ基因mRNA在肾脏组织中的表达量最低[9]。本研究对贵州白山羊ADIPOQ基因序列和蛋白进行了分析，分析结果有助于对ADPOQ基因序列变异和功能进行深入研究，也为进一步研究ADIPOQ基因对贵州白山羊生长性能和脂肪累积过程中的功能奠定了遗传信息基础。