高山细毛羊骨骼肌细胞的特性检定

卢美琳，石嘉琛，王家敏，乔自林＊

（1.西北民族大学生物医学研究中心 甘肃省动物细胞技术创新中心，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学生物医学研究中心 生物工程与技术国家民委重点实验室,甘肃 兰州 730030；3.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030）

甘肃高山细毛羊是20世纪80年代初通过杂交改良培育的毛肉兼用的地方品种，适应高海拔牧区，生产性能优良的绵羊品种之一，种质资源价值高[1，2]。甘肃高山细毛羊的肉质营养含量丰富、营养价值高, 深受西北居民喜爱。我国通过国家科技基础条件平台项目《畜禽种质资源的收集、整理和保存》的开展，保存优良品种遗传资源。因甘肃高山细毛羊是保存的重要品种之一，通过建立骨骼肌细胞等细胞库从细胞水平上进行资源保存。为评估保存细胞的质量状况，开展了该细胞的生物学特性和外源污染物的检查。

1 材料

1.1 主要试剂及材料

甘肃高山细毛羊骨骼肌细胞，由西北民族大学生物医学研究中心甘肃省动物细胞技术创新中心从健康的雄性甘肃高山细毛羊采集经培养后液氮中保存，保存的细胞代次为P4代。

DMEM/F12和0.25%胰蛋白酶(兰州百灵生物，批号:20190409和20140425)、胎牛血清（兰州民海生物，批号：20141002）、二苯甲酰胺荧光染料和秋水仙素（Sigma）等。

1.2 仪器设备

倒置生物显微镜（Olympus，CKX-41）、低速离心机（湖南奥鑫公司，LK-C）、普通显微镜（Olympus，CX21）、CO2培养箱（Thermo，3111）、细胞计数仪（Countstar，IC1000）、倒置荧光显微镜（Olympus，IX71）等。

2 方法

2.1 形态学观察

按常规方法复苏甘肃高山细毛羊骨骼肌细胞，用DMEM/F12培养基(含10%胎牛血清+1%双抗)培养，接种培养48 h后在倒置显微镜下观察细胞贴壁情况及其形态，待细胞汇合达到90%左右，常规方法消化传代培养，分瓶比例为1:3。

2.2 生长曲线绘制

选P6代处于对数生长期的细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，用完全培养基制备单细胞悬液，并计数。以1×104个/ml密度接种于24孔细胞培养板，每孔接种1ml，置于37℃ 5%CO2培养箱中培养。每隔24 h用0.25%胰蛋白酶消化3孔计数。以培养天数为横坐标，以细胞密度为纵坐标，绘制细胞生长曲线，并计算其倍增时间和最大增殖密度。

倍增时间[4]=T/A，A=log2（Y/X），式中X为初始接种细胞数，Y为细胞最大增殖密度前一天的细胞数，T为培养时间。

2.3 染色体分析

细胞处理：选处于对数生长期的甘肃高山细毛羊骨骼肌细胞，向细胞培养瓶内加入终浓度为0.1umol/L秋水仙素，继续培养6 h后，弃掉上清液。

细胞消化：用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，1 000 r/min离心8 min，弃上清液，加入0.4% KCL，室温放置20 min。

细胞固定：加固定液（冰醋酸：甲醇=1:3），预固定10 min，1 000 r/min离心10 min收集沉淀细胞，再加固定液重悬细胞，在涡流混悬器上振荡完全，在冰上静止10 min。重复固定重悬一次。

滴片及拍照：取细胞悬液滴到预冷的玻片上，使细胞充分分散，待干燥后于镜下观察，选择细胞均匀分散的玻片用Giemsa染色，显微镜下观察清晰染色体并拍照。

染色体计数：用Photoshop软件计数染色体。

2.4 外源支原体污染检查

用不含双抗的完全培养基培养甘肃高山细毛羊骨骼肌细胞，连续传代培养3代，取待第3代细胞完全汇合，且3天未换液的细胞，连同细胞培养瓶放置-20℃反复3次冻融，离心取上清备用。

选用Vero细胞作为指示细胞，培养液中加20%上述制备上清液后连续传代培养3代，待第三代培养3天后，弃掉培养液,加入固定液5ml,放置5min进行预固定，第二次固定10 min，弃掉固定液，用PBS液洗三次，吸干PBS液后加二苯甲酰胺荧光染料工作液5ml,室温避光孵育30 min，吸出染液，用蒸馏水洗3次,吸干水使其干燥用荧光显微镜观察并拍照。用无抗生素培养基培养Vero细胞，作为阴性对照组。

用已知阳性的供试品标准菌株2ml替代供试品,同法操作,作为阳性对照组。

结果判定：阳性在细胞内、外可见大小不等、不规则的蓝色荧光颗粒, 或丝状物。阴性仅见指示细胞的细胞核呈现蓝色荧光。

3 结果

3.1 形态学观察

骨骼肌细胞复苏活率为90%，培养48 h后细胞形态良好，呈梭型和不规则三角形，见图1A所示；继续培养后细胞形态逐渐汇合，接触更紧密，96 h后形成单层致密，以明显的梭形细胞为主，见图1B。

图1 骨骼肌细胞形态

3.2 生长曲线

骨骼肌细胞P7代生长曲线呈标准的“S”型，见图2。以1×104个/ml密度培养2天后，进入对数生长期，在第9天细胞密度为4.03×105个/ml，达到最高值。其倍增时间为41.78 h，符合细胞的体外生长规律。

图2 骨骼肌细胞生长曲线

3.3 染色体分析

用油镜观察挑选出形态清晰、分散良好的细胞染色体进行拍照，用Photoshop软件进行细胞染色体计数，见图3。骨骼肌细胞的染色体条数为54条。

图3 骨骼肌细胞染色体图

3.4 支原体检查

未加待检细胞培养上清液的Vero细胞作为阴性对照组，其结果是仅在细胞核中有蓝色荧光出现见图4A；试验组只在细胞核有蓝色荧光出现，而核外无任何荧光颗粒见图4B；而阳性对照组除在细胞核有蓝色荧光出现外，细胞核外也出现大小不等且不规则的蓝色荧光着色颗粒，见图4C；试验组结果与阴性对照组结果一致。

图4 支原体检查（×40）

4 讨论

甘肃高山细毛羊是我国1980年育成的第一个高山型细毛羊品种[4]，是甘肃特有的细毛羊品种[5]，为了防止种质资源的流失，试验从细胞水平对甘肃高山细毛羊骨骼肌细胞建立细胞库，并对保存质量进行检测。通过细胞形态可以评估细胞的保存的质量，细胞生长曲线可以反映细胞的增殖能力；染色体核型分析来鉴定细胞系的性别来源和种属来源的确切指标[6]。保存的甘肃高山细毛羊骨骼肌细胞形态呈梭形，生长曲线呈“S”型，染色体为54条，无外源支原体污染，细胞形态良好，增殖速度快，倍增时间短，为二倍体细胞，无外源物污染，从细胞水平上成功保存了甘肃高山细毛羊的种质资源。