Ca2+、Mg2+对苦丁茶总黄酮提取及其抑菌活性的影响

2020-04-29张亦琳延永贺燕玲

商洛学院学报 2020年2期

张亦琳，延永，贺燕玲

（商洛学院生物医药与食品工程学院，陕西商洛 726000）

苦丁茶（Ilex kudingcha），属冬青科（Aquifoliaceae）冬青属常绿乔木，山坡、竹林、灌木丛中常见，在我国西南地区及华南地区广泛分布[1]。据记载，这种植物已经作为药草使用了2000 多年，因其独特作用而受到科学家的广泛关注。丰富的黄酮类物质[2]、氨基酸[3]、苦味苷[4]等物质是苦丁茶独具特色之处，而黄酮类物质具有抑菌[5]、抗皮肤衰老[6-7]和消除自由基[8]的作用，一直以来是研究的热点。随着国际社会对化学药品给人类社会造成潜在危害的反思和回归自然的呼声不断提高，许多国家日益重视天然药物的研究和开发，这是我国的中药发展非常难得的机遇。据《本草纲目》记载，雨水、井水、露水对中草药进行煎煮后，其药效各有所不同[9]，其本质原因是雨水、井水、露水的硬度不同，而硬水中离子含量最大的是Ca2+、Mg2+，研究发现，金属离子对药物的疗效有重要影响，药物与金属离子结合，形成配合体或鳌合物，促使体内某一离子浓度受药物的影响增加或减少，提高药物疗效或者增加其毒性，使药物的临床疗效发生改变[10]。其可能的原因是离子与药物形成配合体后，药物的脂溶性增加，更易于透过细胞膜，有些药物进入人体内之后，必须与金属离子配位，改变与其结合的原生物配体的生物功能，才能更好地发挥药效。但在植物有效成分的提取研究中，尚未见关于重金属离子对植物提取物及其生物活性影响的报道。本研究考察了自然界水中含量最多的Ca2+、Mg2+对苦丁茶总黄酮提取和抑菌活性的影响。通过单因素试验和响应面法优化出引入Ca2+、Mg2+的最佳苦丁茶总黄酮提取工艺，得到引入Ca2+、Mg2+的苦丁茶总黄酮提取物，通过抑菌试验，得出Ca2+、Mg2+对苦丁茶总黄酮提取物抑菌活性的影响，为研究硬水中常见Ca2+、Mg2+对植物资源开发利用的影响提供新的思路和建立理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

苦丁茶购自四川峨眉山，经鉴定品种为冬青科冬青属苦丁茶干叶。

1.2 试剂与仪器

无水乙醇（AR，利安隆博华医药化学有限公司），NaNO3、Al(NO3)3、MgCl2、NaOH、CaCl2（AR，天津科密欧化学试剂有限公司），芦丁标准品（纯度95%，中国药品生物制品研究所），MH 培养基（BR，北京奥博星生物技术有限责任公司），红四氮唑（AR，天津志远科技有限公司），金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌（受赠于西北大学化学与材料科学学院）。

UV-225 紫外分光光度计（大连市仪器制造公司）、MLS-3780 高压蒸汽灭菌锅（上海鼎谦生物科技有限公司）、ZD-85 恒温振荡器（常州智博瑞仪器制造有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 样品中总黄酮提取率的测定

芦丁标准曲线的绘制方法见文献[10]，0、0.0040、0.0080、0.0120、0.0161、0.0200、0.0241 mg·mL-1的芦丁标准品稀释液，放置15 min 后，在510 nm波长处分别测定吸光度（A）。以横坐标X 为不同质量浓度的芦丁标品溶液，纵坐标Y 为溶液对应的吸光度值，绘制标准曲线。

取1 mL 提取液加入到25 mL 容量瓶，后续同文献[10]，测定药液的吸光度值，计算苦丁茶总黄酮提取率：

式中，Y 为苦丁茶总黄酮的提取率（%），C 为苦丁茶提取液质量浓度（mg·mL-1），N 为提取稀释倍数，V 为提取液体积（mL），W 为提取药材的质量（mg）。

1.3.2 单因素试验

将苦丁茶粉末1.00 g 加入100 mL 单口圆底烧瓶，提取溶剂30 mL，提取温度60 ℃，料液比1:30，乙醇体积分数60%，提取时间2 h，Mg2+浓度200 mg·L-1，Ca2+浓度为 200 mg·L-1为基础提取条件。将 Ca2+浓度分别调整为 125、150、175、200、225 mg·L-1，测试 Ca2+浓度对苦丁茶总黄酮提取率的影响；将 Mg2+浓度分别调整为 125、150、175、200、225 mg·L-1，测试 Mg2+浓度对苦丁茶总黄酮提取率的影响；将乙醇体积分数分别调整为40%、50%、60%、70%、80%，测试乙醇体积分数对苦丁茶总黄酮提取率的影响；将提取时间分别调整为 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，测试提取时间对苦丁茶总黄酮提取率的影响；将料液比分别调整为 1:10、1:20、1:30、1:40、1:50，考察料液比对苦丁茶总黄酮提取率的影响。

1.3.3 苦丁茶总黄酮的抑菌活性

MH 培养基的制备[11]，菌种活化[12]、菌悬液的配制参考文献[13]。采用微量二倍稀释法[14]，得到提取过程中引入Ca2+、Mg2+的提取物溶液的稀释液，各孔总黄酮浓度分别为 97.44、48.72、24.36、12.18、6.09、3.05、1.52、0.76、0.38、0.19、0.10 mg·mL-1，对照品1 为不引入Ca2+、Mg2+的苦丁茶总黄酮提取物稀释液，各孔总黄酮浓度分别为114.08、57.04、28.52、14.26、7.13、3.57、1.78、0.89、0.45、0.22、0.11 mg·mL-1。对照品 2 为传统苦丁茶总黄酮提取物溶液中加入Ca2+、Mg2+后的稀释液，对应孔中总黄酮浓度与对照品1 各浓度相同。提取液、对照品 2、对照品 3 中 Ca2+、Mg2+浓度一致，第一孔浓度中分别为 181、180 mg·L-1。对照品 3 为 Ca2+溶液（第一孔中浓度 181 mg·L-1），对照品 4 为 Mg2+溶液（第一孔中浓度 180 mg·L-1），对照品 5 为 Ca2+、Mg2+溶液（浓度分别为 181、180 mg·L-1）。在上述各浓度药液和对照品中依次加入100 μL 的三种菌液，无菌、恒温37 ℃条件下放置24 h，观察96孔板颜色，得到最小抑菌浓度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

通过Origin 模拟出总黄酮的线性回归方程为 Y=9.9418X+0.0026（R2=0.9964）。分别将各因素水平提取液的吸光度值带入式(1)，即可得与之对应总黄酮提取率。如图1 所示，随着Ca2+浓度增大，苦丁茶总黄酮的提取率不断增大，当Ca2+浓度升高到175 mg·L-1时，黄酮提取率达到最大值9.74%，随后出现下降趋势，根据提取率高低，取Ca2+浓度为 150、175、200 mg·L-1三个水平进行响应面优化；Mg2+浓度对提取的影响与Ca2+浓度相似，当 Mg2+浓度升高到 175 mg·L-1时，黄酮提取率达到最大值9.97%，根据提取率高低，选取Mg2+浓度为150、175、200mg·L-1的三个水平进行响应面优化；乙醇体积分数在40%～60%时，与苦丁茶总黄酮的提取率成正相关，当乙醇体积分数增大到60%时，黄酮提取率达到最大值9.70%，根据提取率的高低，选择50%、60%、70%的乙醇体积分数三个水平进行响应面分析；提取时间在1 h 时，提取率达到最大值9.80%，随后小幅下降，但其总体趋势平稳，故不做响应面分析，选用1 h 作为提取时间；在测试范围内，料液比与提取率呈现先升后降的趋势，料液比是1:30 时提取率达到最大值9.69%，根据总黄酮提取率的高低，选取料液比为1:20、1:30、1:40 三个水平进行响应面分析。

图1 单因素对苦丁茶总黄酮的提取的影响

2.2 响应面试验设计与结果

2.2.1 响应面试验设计

单因素试验确定苦丁茶总黄酮提取工艺影响最大的因素水平，如表1 所示。利用Design-Expert 8.0.6 Trial 软件中Box-Benhnken 方法设计响应面试验。得出引入Ca2+、Mg2+的苦丁茶总黄酮提取物的最佳提取工艺。

表1 苦丁茶总黄酮提取的响应面因素与水平表

利用Box-Benhnken 实验设计，以苦丁茶总黄酮提取率（Y）为响应值，结果见表2。

经软件模拟得到回归方程为：Y=10.02+0.109A＋0.024B－0.033C＋0.032D＋0.0580AB－0.07AC－0.015AD－0.098BC－0.22BD＋0.188CD－0.319A2－0.226B2－ 0.13C2－0.491D2

方差分析见表3，P<0.05 表示所建立模型具有高度的显著性。模型的决定系数R2=0.94，说明因变量与全体自变量之间的多元回归关系显著，回归方程很好地模拟真实曲面，实验可靠；R2Adj=0.88，说明该模型能解释88%实验数据的变异性，拟合程度高，误差小。失拟项P=0.0501，不显著，说明该模型与实际实验拟合度良好，可用于苦丁黄酮提取的分析和预测。各因素标准回归系数大小顺序为A>C>D>B，对苦丁茶中黄酮提取率的影响大小顺序为Ca2+浓度>乙醇体积分数>料液比>Mg2+浓度。

2.2.2 苦丁茶总黄酮提取的响应面交互作用分析

如图2 所示，各因素交互作用下苦丁茶总黄酮得率的响应曲面可以很直观地反映出各因素对苦丁茶总黄酮提取率的影响。乙醇浓度、料液比、Ca2+浓度、Mg2+浓度在测试范围内具有相互影响和作用。响应面曲面斜率越大说明对应的因素对提取影响显著，综合观察，Ca2+离子对苦丁茶总黄酮提取影响最大，与回归方程中的系数所表示的结果一致。

表2 苦丁茶总黄酮提取响应面试验方案及结果

模型模拟得出苦丁茶总黄酮提取的最佳提取工艺条件为 Ca2+浓度为 180.58 mg·L-1、Mg2+浓度为179.56 mg·L-1、乙醇体积分数为56.94%、料液比（g：mL）为 1:29.30、提取 1 h，预测苦丁茶总黄酮提取率为10.04%。

2.3 验证性试验

为了便利操作将模拟工艺调整为Ca2+浓度为181 mg·L-1、Mg2+浓度为 180 mg·L-1、乙醇体积分数为57%、料液比（g：mL）为1:29、提取为1 h，重复测试三次，苦丁茶总黄酮提取率分别为10.16%、10.12%、10.13%，平均值为10.14%，RSD=0.2054，表明提取工艺稳定可靠，试验结果与模型模拟值相近，传统苦丁茶中总黄酮的得率为9.25%，可见，在提取中引入Ca2+与Mg2+能有效提高苦丁茶总黄酮的提取率。

表3 苦丁茶总黄酮提取的方差分析

2.4 苦丁茶中总黄酮的抑菌活性

由表4 所示，提取液对三种菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）最小抑菌浓度分别为 12.18、6.09、12.18 mg·mL-1，未引入 Ca2+、Mg2+提取液的最小抑菌浓度分别为14.26、28.52、28.52 mg·mL-1，单独的 Ca2+溶液、Mg2+溶液或 Ca2+与Mg2+溶液混合液对三种菌均没有抑菌作用。可见引入Ca2+、Mg2+后能显著提升苦丁茶总黄酮抑菌活性，而传统苦丁茶总黄酮提取物溶液中后补加入Ca2+、Mg2+则对抑菌活性影响不大，Ca2+溶液、Mg2+溶液或者Ca2+和Mg2+溶液无抑菌活性。可推测，提取过程引入Ca2+和Mg2+与苦丁茶总黄酮化合物可能生成某种具有较强抑菌活性的配合物，且反应条件与苦丁茶总黄酮的提取过程相似，而补加Ca2+、Mg2+由于没有参与提取过程，缺少相应反应的条件，未形成较强抑菌活性的配合物。因此，提取过程中引入Ca2+和Mg2+有助于提升苦丁茶总黄酮的抑菌活性。

3 讨论与结论

本文考察了Ca2+和Mg2+对苦丁茶的提取和抑菌生物活性的影响。通过单因素试验，筛选出对苦丁茶总黄酮影响最显著的因素水平，采用响应面分析中Box-Behnken 试验设计优化出苦丁茶总黄酮提取最优工艺，即Ca2+浓度181mg·L-1、Mg2+浓度 180 mg·L-1、乙醇浓度 57%、料液比（g:mL）为 1:29，提取时间为 1 h。经验证，该工艺的提取率平均值为10.14%，与传统的提取工艺比较提取率有小幅度的提升。测试了在提取过程中引入Ca2+、Mg2+提取液的抑菌效果，结果表明：在苦丁茶总黄酮的提取过程中引入Ca2+、Mg2+后能显著提升其抑菌活性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的MIC值为 14.26、28.52、28.52 mg·mL-1，明显低于对照组。

该工艺为苦丁茶的提取提供了更多的选择，使得苦丁茶总黄酮的提取成本得到降低，提取溶剂由“蒸馏水+乙醇”延伸为“自来水+乙醇”。同时，提取物对本研究中三种测试菌的最小抑菌浓度有较为明显的降低，可推测在提取过程中溶液中的Ca2+和Mg2+能与苦丁茶总黄酮化合物形成某种具有较强抑菌活性的配合物，因此，在苦丁茶总黄酮开发和利用过程中应该充分考虑并利用金属离子对其活性的影响。本研究为中药发展提供了新的思路，为研究离子对中药药效重要作用开辟了理论基础。