天地镇颤方颗粒剂、口腔速溶散抗帕金森病的比较药理学研究

夏 鹏赵生玉文 雯高丽娟付 颖韩 丽徐世军∗

（1.成都中医药大学药学院，四川 成都 611137；2.成都中医药大学中医脑病药物整合转化研究所，四川成都 611137）

药物剂型与药效密切相关［1］，因此合理的选择药物制剂形态是确保成药疗效的重要环节。口腔速溶散是一种口腔黏膜给药的新剂型，由药物与3 种水溶性辅料混合制备成的超微口腔速溶粉末。药物在口腔内遇唾液可迅速溶散混悬呈流体，经口腔黏膜、舌下及消化道快速吸收而提高了药物生物利用度［2］，相较其它口服给药剂型（如颗粒剂、片剂、胶囊等）具有吸收多、生物利用度较高、服用方便、顺应性高等优点，在老年人群用药和顺应性不足的患者中具有优势。天地镇颤方是由天麻、熟地黄、全蝎组成的抗帕金森病（Parkinson's disease，PD）的专利处方（201711205034.4），为了筛选确定该方合适的制剂剂型，本研究采用比较药理学的研究思路，在3 种拟PD 动物模型上比较颗粒剂和口腔速溶散药效学的异同。

1 材料

1.1 药物 天地镇颤颗粒剂（20180619）、口腔速溶散（批号20180731），均购自成都中医药大学中药制剂与炮制系；美多巴（批号SH3580）购自上海罗氏制药有限公司。

1.2 动物 KM 雄性小鼠，SPF 级，体质量18～22 g，合格证号51203500 005873；C57BL／6 雄性小鼠，SPF 级，体质量18～22 g，合格证号51203500006753，均购自成都达硕实验动物有限公司，生产许可证号SCXK（川）-2015-030。

1.3 试剂 氢溴酸槟榔碱（南京道斯夫生物科技有限公司，批号170502S）；氧化震颤素（美国Sigma 公司，批号033M4724V）；1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP，大连美仑生物技术有限公司，批号S0 620 A）；抗酪氨酸羟化酶（TH）抗体（英国Abcam 公司，批号GR3219792-1）；超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（批号20180922、20190316）和丙二醛（MDA，批号20180922、20190316）测试盒，均购自南京建成生物工程研究所。

1.4 仪器 ZZ-6 型自主活动测试仪（成都泰盟科技有限公司）；OFT-100 型大小鼠开场活动实验系统（成都泰盟科技有限公司）；Multiskan FC 型酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪（常州市中威电子仪器有限公司）；BA400Digital 型数码三目摄像显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）；SYFM-8II 型振动式药物超微粉碎机（济南倍力公司）；HX-200 高速中药粉碎机（浙江省永康市溪岸五金药具厂）。

2 方法

2.1 药物制备 口腔速溶散：采用振动磨将主药物研磨至5～20 μm；乳糖粉、葡萄糖粉混合研磨成粒径为0.3～5 μm的粉末，与薄荷油、木糖醇混合研磨至0.2～3 μm，将上述两部分粉末在振动磨中1∶1 混匀，即得。

颗粒剂：天麻以70 ℃、40% 乙醇提取，低温减压浓缩，喷雾干燥，得到干燥粉；药渣以水提取，低温减压浓缩，得到稠浸膏；熟地以70% 乙醇提取，低温减压浓缩，得到稠浸膏；全蝎以中药粉碎机粉碎，粉末全部通过5 号筛，95%通过6 号筛，最后合并上述药物，湿法制粒，干燥，整粒，即得。

2.2 造模、分组及给药

2.2.1 氢溴酸槟榔碱致震颤模型 50 只KM 小鼠按体质量分层随机分为空白对照组、氢溴酸槟榔碱组、美多巴组（50 mg／kg）、天地镇颤颗粒组（2.70 g／kg）、天地镇颤口腔速溶散组（2.70 g／kg），每组10 只。除空白对照组和氢溴酸槟榔碱组小鼠灌胃给予生理盐水外，其余各组小鼠灌胃给予相应药物，1 次／d，给药体积为10 mL／kg，连续14 d。末次给药1 h 后，除空白对照组小鼠腹腔注射生理盐水外，其余各组小鼠腹腔注射氢溴酸槟榔碱（25 mg／kg）溶液造模［3-4］，给药体积为10 mL／kg。

2.2.2 氧化震颤素致震颤模型 除造模用药换为氧化震颤素（0.15 mg／kg）［3-4］外，其余分组、给药方法均同“2.2.1”项。

2.2.3 MPTP 致PD 模型 52 只C57BL／6 小鼠按体质量分层随机分为空白对照组、MPTP 组、美多巴组（50 mg／kg）、天地镇颤颗粒组（2.70 g／kg）和口腔速溶散组（2.70 g／kg），除空白对照组8 只小鼠外，其余每组均为11只。除空白对照组小鼠腹腔注射生理盐水外，其他各组小鼠腹腔注射新鲜配置的MPTP（30 mg／kg）生理盐水［5］，1 次／d，给药体积为10 mL／kg，连续7 d。第8 天开始除空白对照组及MPTP 组小鼠灌胃给予生理盐水外，其余各组小鼠灌胃给予相应药物，1 次／d，给药体积为10 mL／kg，连续14 d。

2.3 行为学检测 氢溴酸槟榔碱致震颤实验：末次给药1 h后，除空白对照组小鼠腹腔注射生理盐水外，其余各组小鼠腹腔注射氢溴酸槟榔碱，记录小鼠震颤潜伏期（腹腔注射氢溴酸槟榔碱后到出现肌肉震颤的时间）及震颤持续时间（出现肌肉震颤到肌肉震颤消失的时间）。氧化震颤素致震颤实验：除造模药换为氧化震颤素外，行为学测试方法同氢溴酸槟榔碱致震颤实验。MPTP 致PD 实验：末次给药1 h 后，自主活动记录仪记录小鼠的自主活动次数及站立次数，开场实验系统记录小鼠5 min 内的运动时间及运动总距离，最后记录小鼠由头朝上放于顶端小球至头朝下爬下小球至杆的时间（T1）及由杆顶端至爬向杆底部的时间（T2）。

2.4 MDA、SOD 水平测定 氢溴酸槟榔碱及氧化震颤素致震颤实验行为学测试后，快速处死小鼠，冰浴无菌快速分离黑质和纹状体，采用试剂盒检测MDA、SOD 水平。MPTP 致帕金森模型动物爬杆实验后，快速处死小鼠，取脑组织匀浆检测MDA、SOD 水平。

2.5 TH 免疫组化 实验后，每组随机取4 只小鼠，冰浴无菌快速取脑，分离黑质，4%多聚甲醛固定，用于多巴胺神经元的免疫组织化学检测。

2.6 统计学分析 采用Graphpad Prism 7.0 软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 2 种剂型对氢溴酸槟榔碱致震颤模型小鼠影响的比较

3.1.1 小鼠震颤行为学 如图1 所示，与氢溴酸槟榔碱组比较，2 种剂型均可一定程度延长模型小鼠震颤潜伏期，差异无统计学意义（P＞0.05），同时颗粒剂可以缩短小鼠震颤持续时间（P＜0.05）。

图1 2 种剂型对氢溴酸槟榔碱致震颤小鼠震颤行为学的影响

3.1.2 黑质和纹状体MDA、SOD 水平 如图2 所示，与空白对照组比较，氢溴酸槟榔碱组小鼠黑质MDA、SOD 水平无明显变化（P＞0.05），但纹状体MDA 水平增高、SOD水平降低（P＜0.05）；与氢溴酸槟榔碱组比较，2 种剂型降低小鼠纹状体MDA 水平（P＜0.05），同时口腔速溶散亦能增加模型小鼠纹状体SOD 水平（P＜0.05）。

图2 2 种剂型对氢溴酸槟榔碱致震颤小鼠黑质和纹状体MDA、SOD 水平的影响

3.2 2 种剂型对氧化震颤素致震颤模型小鼠影响的比较

3.2.1 小鼠震颤行为学 如图3 所示，与氧化震颤素组比较，颗粒剂能延长模型小鼠的震颤潜伏期，缩短震颤持续时间（P＜0.05）。临床相同剂量下，颗粒剂延长震颤潜伏期显著优于口腔速溶散（P＜0.05）。

图3 2 种剂型对氧化震颤素致PD 模型小鼠震颤行为学的影响

图4 2 种剂型对氧化震颤素致震颤小鼠黑质和纹状体MDA、SOD 水平的影响

3.2.2 黑质和纹状体MDA、SOD 水平 如图4 所示，与氧化震颤素组比较，2 种剂型对小鼠黑质MDA、SOD 水平均无影响（P＞0.05），但颗粒剂可降低模型小鼠纹状体MDA水平，增加SOD 水平（P＜0.05），而口腔速溶散仅可增加纹状体SOD 水平（P＜0.05）。临床相同剂量下，2 种剂型比较，颗粒剂降低MDA 水低于口腔速溶散（P＜0.05），但SOD 水平高于口腔速溶散（P＜0.05）。

3.3 2 种剂型对MPTP 致PD 模型小鼠影响的比较

3.3.1 小鼠自主活动 如图5 所示，与空白对照组比较，MPTP 组小鼠自主活动次数及站立次数均减少（P＜0.05）；与MPTP 组比较，2 种剂型均能够提高模型小鼠的自主活动次数及站立次数（P＜0.05）。临床相同剂量下，2 种剂型比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

图5 2 种剂型对MPTP 致PD 小鼠自主活动的影响

3.3.2 开场实验 如图6 所示，与空白对照组比较，MPTP 组小鼠开场运动时间及运动距离减少（P＜0.01）；与MPTP 组比较，2 种剂型均能够提高模型小鼠的开场实验运动时间和运动总距离（P＜0.05，P＜0.01）。临床相同剂量下，2 种剂型比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

图6 2 种剂型对MPTP 致PD 小鼠开场实验的影响

3.3.3 爬杆实验 如图7 所示，与空白对照组比较，MPTP 组小鼠T1、T2 均延长（P＜0.05，P＜0.01）；与MPTP组比较，口腔速溶能够缩短TI、T2（P＜0.05），颗粒剂对两者T1、T2 无影响（P＞0.05）。临床相同剂量下，2 种剂型对T1、T2 的影响比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图7 2 种剂型对MPTP 致PD 小鼠爬杆实验的影响

3.3.4 脑MDA、SOD 水平 如图8 所示，与空白对照组比较，MPTP 组小鼠脑内MDA 水平增高，SOD 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）；与MPTP 组比较，2 种剂型均能够降低小鼠脑内MDA 水平，并增加SOD 水平（P＜0.05，P＜0.01）。临床相同剂量下，2 种剂型比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

图8 2 种剂型对MPTP 致PD 小鼠脑内氧化应激的影响

3.3.5 对黑质TH 神经元阳性表达影响 如图9 所示，与空白对照组比较，MPTP 组小鼠黑质内多巴胺神经元大面积死亡，形态受损严重（细胞核固缩严重，碎裂），阳性染色显著变淡，阳性染色神经元数量显著减少（P＜0.05）；与MPTP 组比较，天地镇颤颗粒和口腔速溶散组存活细胞增多，正常形态神经元增高，阳性染色增强，存活神经元数目增高（P＜0.05）。虽然2 种剂型之间存活神经元数目比较，差异无统计学意义（P＞0.05），但口腔速溶散组存活多巴胺神经元的形态较颗粒剂完整，核固缩、碎裂细胞较少。

图9 黑质多巴胺神经元TH 免疫组化

4 讨论

震颤和运动障碍是PD 主要临床特征，黑质多巴胺神经元损伤导致脑内多巴胺（dopamine，DA）低下是其发病根本原因［5］，补充脑内DA 的左旋多巴替代疗法［6］是当前临床常用干预措施，但不能减缓甚至阻止患者黑质多巴胺神经元的变性过程。氧化应激损伤是PD 公认的发病机制之一［7］，因此研发既能改善临床症状和保护多巴胺神经元、又能抗氧化应激损伤的药物是PD 干预药物的重要方向。颗粒剂和口腔速溶散都是经消化道给药的剂型，虽然颗粒剂载药量大，药物稳定性较高［8］，但对PD 患者而言顺应性较差；口腔速溶散分散程度高，溶解度高，药物除与颗粒剂相同的胃肠吸收外，口腔快速溶散后可口腔黏膜、舌下黏膜和舌下静脉等途径吸收，吸收途径多，生物利用度相对较高。为了比较天地镇颤方2 种剂型的优劣，本实验采用了氢溴酸槟榔碱和氧化震颤素损伤胆碱能神经的震颤模型，以及MPTP 损伤多巴胺神经所导致的PD 模型，进行了比较药理学研究。

氢溴酸槟榔碱及氧化震颤素均为胆碱能神经激动剂，乙酰胆碱（ACH）的生理作用与DA 相反，正常生理状态下2 种递质在脑内维持动态平衡［9］，帕金森病抗胆碱药物主要通过抑制ACH 活性，提高DA 效应［10］发挥作用。本研究发现，天地镇颤颗粒剂和口腔速溶散均能改善2 种模型的震颤行为异常，提高纹状体SOD 水平，降低MDA 水平，但颗粒剂较口腔速溶散为优。MPTP 为一种神经毒素，能特异性地进入多巴胺神经元并产生神经毒性［11］，损害多巴胺神经元，导致小鼠产生明显的运动障碍、伴随抑郁行为［12］。天地镇颤颗粒剂、口腔速溶散均可使小鼠的自主活动次数及站立次数明显增多、开场运动时间及距离增加，提示2 种剂型均能够减轻模型小鼠的运动障碍，抑郁症状，但口腔速溶散能缩短模型小鼠爬杆实验T1、T2，具有提高运动协调能力的作用；2 种剂型均可降低脑MDA 水平并提高SOD 水平，并能保护多巴胺神经元免受损伤，抗氧化应激作用相似，但口腔速溶散对多巴胺神经元保护作用更为显著。综上可见，颗粒剂在通过胆碱能神经保护改善帕金森病具有优势，但口腔速溶散在保护多巴胺神经、抗氧化应激损伤和改善运动协调方面优于颗粒剂，同时考虑其多途径吸收提高生物利用度、服用方便增强顺应性的特点，可以作为天地镇颤方制剂成型工艺的优选方案。