UPLC-QQQ-MS／MS 法同时测定不同产地知母中10 种成分

赵小勤，许 莉，文永盛，高 鹏，黄晓婧

（成都市食品药品检验研究院，国家药品监督管理局中药材质量监测评价重点实验室，四川 成都 610045）

知母为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloidesBge.的干燥根茎，具有清热泻火、滋阴润燥等功效，临床用于外感热病、高热烦渴、肺热燥咳，内热消渴等症［1］，具有抑制血小板聚集［2-4］、降血糖［5-7］、抗抑郁［8-10］和抗阿尔兹海默病［11-13］等药理作用。知母含有甾体皂苷、黄酮类、木脂素类、生物碱、多糖及有机酸等成分，其中主要活性物质为甾体皂苷和黄酮类，两者也是其重要的药理活性物质群，对药材质量评价和控制至关重要［14-16］。

2015 年版《中国药典》 采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD）测定知母甾体皂苷类成分知母皂苷BⅡ的含有量，高效液相色谱-紫外光检测法（HPLC-UV）测定黄酮类成分芒果苷的含有量［1］，但质量控制指标较单一，指标性成分的代表性不够，很难反映药材整体质量。知母中含有的大部分甾体皂苷类成分无紫外吸收，故紫外检测器不适用于含有量测定，同时这些成分在蒸发光散射检测器上的响应也较低［17-19］，因此，HPLC-UV 或HPLC-ELSD 都不是最佳的定量分析方法。超高效液相质谱-三重四级杆质谱联用法（UPLC-QQQ-MS／MS）具有分析时间短、分离度好、灵敏度高的优点，近年来被广泛用于中药多组分的分析，本研究建立该方法同时测定知母中10种成分的含有量，以期为该药材及其成药的质量评价提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1290 超高效液相色谱仪串联／6470 三重四级杆质谱仪（美国Agilent 公司）；AUX220 电子天平（万分之一，日本岛津公司）；XPE26 电子天平（百万分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；SK250H 超声仪（上海科导超声仪器有限公司）。

1.2 材料 芒果苷（纯度98.4%，111607-201503）、知母皂苷B Ⅱ（纯度94.4%，111839-201505）对照品均购自中国食品药品检定研究院；新芒果苷（纯度99.73%，MUST-16042232）、异芒果苷（纯度99.81%，MUST-16100905）、知母皂苷AⅠ（纯度98.00%，MUST-17022810）、知母皂苷AⅡ（纯度99.59%，MUST-16112415）、知母皂苷AⅢ（纯度98.78%，MUST-16020108）、知母皂苷BⅢ（纯度96.93%，MUST-17022210）、知母皂苷E1（纯度99.15%，MUST-17031401）、知母皂苷Ⅰ（纯度99.15%，MUST-17031401）对照品均购自成都曼斯特生物科技有限公司。乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；甲酸（质谱纯，美国Fisher 公司）；水为超纯水。20 批知母实地采自山西、河北、陕西、内蒙古等道地产区，经成都市食品药品检验研究院文永盛中药师鉴定为百合科知母Anemarrhena asphodeloidesBge.的干燥根茎，具体见表1。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 对照品贮备液制备 精密称取新芒果苷、芒果苷、异芒果苷、知母皂苷AⅠ、知母皂苷AⅡ、知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷E1、知母皂苷Ⅰ适量，加50%甲醇分别配制 成 2.168、1.628、1.804、1.200、1.540、1.810、3.396、1.564、3.208、3.892 mg／mL，即得，在4 ℃下保存备用。

2.2 供试品溶液 取本品粉末（过3 号筛）约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称定质量，立即超声处理（250 W、53 kHz）40 min，放冷，50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液1 mL 置于50 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，再取1 mL 溶液置于10 mL 量瓶中，加50%甲醇至刻度，即得。

2.3 色谱条件 Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱温30 ℃；流动相0.01% 甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～3 min，93% A；3～7.5 min，93%～87% A；7.5～8 min，87%～78% A；8～11 min，78%～65% A；11～12.5 min，65%～55% A；12.5～18 min，55%～20% A；18～20 min，20%～5% A；20～22 min，5% A；22～22.5 min，5%～93% A；22.5～25 min，93% A）；体积流量0.4 mL／min；进样量2 μL。

2.4 质谱条件 ESI 离子源，正、负离子交替扫描；MRM 检测模式；毛细管电压3 000 V（+）、3 000 V（-）；喷雾器压力172.368 925 kPa；干燥气温度350 ℃，体积流量8 L／min；EMV 750。总离子流图见图1，质谱参数见表2。

2.5 线性关系考察 精密吸取新芒果苷、芒果苷、异芒果苷、知母皂苷E1、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷Ⅰ、知母皂苷AⅠ、知母皂苷AⅡ、知母皂苷AⅢ贮备液适量，50%甲醇逐级稀释，各精密吸取2 μL，在“2.3”“2.4”项条件下进样。以峰面积为纵坐标（Y），溶液质量浓度为横坐标（X）进行回归，以信噪比（S／N）3 为最低检出限（LOD），信噪比（S／N）10 为最低 定量限（LOQ），结果见表3，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.6 精密度试验 精密吸取含有量已知的新芒果苷、芒果苷、异芒果苷、知母皂苷E1、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷Ⅰ、知母皂苷AⅠ、知母皂苷A Ⅱ、知母皂苷A Ⅲ对照品溶液，在“2.3”“2.4”项条件下连续进样6 次，每次2 μL，测得10 种成分峰面积RSD 分别为0.68%、0.98%、1.21%、1.25%、0.45%、0.96%、1.51%、2.19%、1.83%、1.96%，表明仪器精密度良好。

图1 各成分总离子流图Fig.1 Total ion current chromatograms of various constituents

表2 10 种成分质谱参数Tab.2 MS parameters for ten constituents

表3 各成分线性关系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.7 重复性试验 取同一批样品粉末6 份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”“2.4”项条件下进样，测得新芒果苷、芒果苷、异芒果苷、知母皂苷E1、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷Ⅰ、知母皂苷AⅠ、知母皂苷AⅡ、知母皂苷AⅢ含有量RSD 分别为1.38%、1.14%、1.64%、2.07%、1.29%、2.00%、1.17%、1.57%、1.75%、0.53%，表明该方法重复性良好。

2.8 稳定性试验 取同一份样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”“2.4”项条件下于0、4、8、16、24 h 进样，测得新芒果苷、芒果苷、异芒果苷、知母皂苷E1、知母皂苷B Ⅱ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷Ⅰ、知母皂苷AⅠ、知母皂苷A Ⅱ、知母皂苷A Ⅲ峰面积RSD 分别为0.37%、0.33%、2.01%、1.26%、1.14%、0.62%、1.26%、2.53%、1.97%、1.05%。表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.9 加样回收率试验 精密称取含有量已知的同一样品粉末9 份，每份约0.1 g。取新芒果苷、芒果苷、异芒果苷、知母皂苷E1、知母皂苷B Ⅱ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷Ⅰ、知母皂苷AⅠ、知母皂苷AⅡ、知母皂苷AⅢ对照品，配制成适当质量浓度的对照品溶液，以原含有量的50%、100%、150%加到样品粉末中，平行3 份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”“2.4”项条件下进样，测得10 种成分的平均加样回收率分别为97.18%、97.30%、97.07%、99.84%、99.15%、98.51%、97.80%、98.39%、99.42%、101.31%，RSD 分别为 1.90%、1.52%、2.09%、1.62%、1.22%、2.59%、2.53%、2.18%、1.19%、1.99%。

2.10 样品含有量测定 对20 批样品粉末进行精密称取，每批约0.2 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，各精密吸取2 μL，在“2.3”“2.4”项条件下进样，计算含有量，结果见表4。

表4 各成分含有量测定结果（mg／g，n＝3）Tab.4 Results of content determination of various constituents（mg／g，n＝3）

2.11 不同产地知母差异成分分析 本研究以知母中10 种成分含有量为变量，采用多元变量统计分析软件SIMCA 14.1，通过正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）建立20 批样品模型，发现陕西和山西产聚为一类，河北和内蒙古产聚为一类，见图2。OPLS-DA 载荷图的每个点代表1 种化学成分，距离原点越远，权重值越大，在决定样品区分中的作用越大，见图3。进一步作VIP 分析可知，各成分贡献值依次为知母皂苷AⅡ、异芒果苷、知母皂苷Ⅰ、知母皂苷BⅢ、新芒果苷、芒果苷、知母皂苷AⅢ、知母皂苷AⅠ、知母皂苷E1、知母皂苷BⅡ，其中知母皂苷AⅡ、异芒果苷、知母皂苷Ⅰ、知母皂苷BⅢ的VIP＞1，表明这4 种成分是区分不同产地知母的主要标志物，见图4。取20 批样品各成分含有量的平均值，绘制成柱状图，见图5。

3 讨论与结论

图2 各样品OPLS-DA 得分散点图Fig.2 OPLS-DA score scatter plot for various samples

图3 各成分OPLS-DA 载荷散点图Fig.3 OPLS-DA score load diagram for various constituents

图4 各成分OPLS-DA VIP 图Fig.4 OPLS-DA VIP diagrams for various constituents

2015 年版《中国药典》 知母含有量测定项下规定，按干燥品计算，含芒果苷（C19H18O11）不得少于0.70%，知母皂苷BⅡ（C45H76O19）不得少于3.0%［1］，本实验中仅有1 批样品（安国石佛镇，S11）知母皂苷BⅡ含有量不达标。前期调研发现，药农通常在知母种植2～3 年时采收，但价格高时会提前，价格低时会延后，河北产地一般种植年限为3 年，而样品S11 为2 年。有文献报道，知母中芒果苷含有量随种植年限延长而降低［20］，皂苷类成分含有量随种植年限延长而升高［21］，但样品S11 中芒果苷较高，知母皂苷BⅡ较低，其原因可能是种植年限较短，故建议规范知母的种植年限和采收时间。知母皂苷BⅡ具有抗氧化［22-23］、抗抑郁［9］、抗肿瘤［24-25］等药理作用，芒果苷具有抗炎、降血糖、抗氧化、调节免疫等作用［15］，两者为《中国药典》 规定的质控指标；知母皂苷AⅢ具有抗肿瘤［26-27］、抗血栓［28］、改善学习记忆［29］等显著的药理活性，特别是能诱导乳腺癌细胞、Hela细胞、结肠癌细胞、黑色素瘤、脑胶质瘤及胰腺癌细胞的凋亡［26-27］，成为近年来研究的热点，可将其也作为知母的质控指标。

图5 各成分含有量柱状图Fig.5 Historgram for various constituents’contents

最初，课题组尝试采用HPLC-ELSD 法同时测定知母中多指标成分含有量［17］，但多数皂苷响应值较低，供试品取样量大，定量计算较困难，因此尝试建立基于UPLC-QQQ-MS／MS 的多指标综合评价方法。除10 种成分外，本研究还考察了知母皂苷C、知母皂苷E、宝藿苷Ⅰ、构树宁的质谱条件，发现其响应值较低，供试品中未检出，故暂未将其列入，需进一步研究。综上所述，本实验建立了基于UPLC-QQQ-MS／MS 多指标综合评价知母质量的方法，其简单快速，准确度好，灵敏度高，可为药材相关研究提供参考。