九香虫水提液化学成分及其对乳腺癌细胞增殖的抑制作用

田 莹檀 军赵 帅郭建军∗

（1.贵州大学昆虫研究所，贵州山地农业病虫害重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.遵义医科大学，组织学与胚胎学教研室，贵州 遵义 563000）

肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下，部分细胞增殖与分化调控异常而形成，细胞凋亡调控机制的失常在恶性肿瘤的发生发展中起到重要作用。乳腺癌是女性癌症中最常见的一种，约占所有女性所患癌症的18%［1］，中国每年乳腺癌发病数可达16.9万，占全球总发病数的12.25%［2］。化疗药物在治疗癌症中疗效显著，但有较大的不良反应，故发掘不良反应小、能抑制肿瘤细胞生长的活性物质是抗肿瘤药物研究的热点之一［3-4］。中药具有不良反应小、增强机体免疫功能、抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡等特点，在临床治疗肿瘤中受到重视［5］。九香虫是具有此类功能的传统中药，属于昆虫纲半翅目兜蝽科昆虫［6］，主要分布于东南亚地区，包括中国、日本、印度、印度尼西亚、马来半岛等地，在我国广泛分布于长江以南地区［7］，始载于《本草纲目》，具有理气止痛、温中助阳的功效，中医用其治疗胃痛、痛经、肾炎、遗精等疾病；现代医学研究发现，九香虫也具有抗肿瘤、抗菌、溶解血栓、治疗常见的消化道疾病及血管瘤等功效［8-10］。

九香虫在抗癌方面具有较好研究基础，可用于治疗食管癌、胃癌等［11］；含九香虫的中药复方香龙散（半夏、天龙、九香虫等）能够诱导人胃癌细胞（HS-746T）凋亡［12］；中药癌痛克（全蝎、土元、九香虫等）可抑制HepG2 细胞增殖及诱导其凋亡而发挥抗肝癌作用［13］。课题组前期研究表明，九香虫血淋巴可抑制乳腺癌细胞MCF-7 和胃癌细胞SGC-7901 增殖，促进细胞凋亡［10，14-15］；九香虫含药血清对人结肠癌细胞SW480 具有抑制增殖、促进凋亡的作用［16］；九香虫三氯甲烷浸提物能抑制胃癌细胞SGC-7901 和肝癌细胞HepG2 增殖，对HepG2 细胞抗肿瘤活性可能是通过阻滞细胞周期［17］。于声等［18］研究表明，九香虫水提液可通过阻滞细胞周期抑制胃癌细胞SGC-7901、肝癌细胞HepG2 增殖，但九香虫水提液的主要成分及其对乳腺癌细胞是否具有抑制增殖作用目前尚未见报道。本研究制备九香虫水提液后分析其主要成分，检测其对乳腺癌细胞的增殖抑制作用，以期为该昆虫开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 九香虫购自贵州省凯里市下司镇，置于恒温干燥箱烘干备用。人乳腺癌细胞系MDAMB-453、HCC-1937 及小鼠乳腺癌细胞4T1 购自中国科学院上海细胞库。

1.2 试剂与药物 L-15 培养基（武汉博士德生物工程有限公司）；RPMI-1640 培养基（美国赛默飞公司）；甲醇（德国CNW Technologies 公司）；L-2-氯苯丙氨酸（上海恒柏生物科技有限公司）；0.22 μm针管式过滤器（美国密理博公司）；SDSPAGE 凝胶配制试剂盒（北京康为世纪有限公司）；考马斯亮蓝R250（北京索莱宝科技有限公司）。

1.3 仪器 倒置相差显微镜（厦门麦克奥迪有限公司）；202 型电热恒温干燥箱（北京永光明医疗仪器厂）；超低温冰箱、Heraeus Fresco17 离心机、酶联免疫检测仪（美国赛默飞公司）；Agilent 7890A 气相色谱仪（美国安捷伦公司）；PEGASUS HT 质谱仪（美国力可公司），PS-60AL 超声仪（深圳雷德邦电子有限公司）；LNG-T98 真空干燥仪（太仓华美生化仪器厂）；垂直电泳系统、凝胶成像系统（美国伯乐公司）。

1.4 方法

1.4.1 样品制备 九香虫用纯水清洗2 次，滤纸吸干虫体表面水分，置于80 ℃电热恒温干燥箱中烘烤4 h。将干燥的九香虫研磨成粉末，称取10 g虫粉，加入20 mL 纯水，置于4 ℃冰箱中浸泡7 d，制备成质量浓度为0.5 g／mL 的水提液，4 ℃、6 000×g离心10 min，吸取上清液，0.22 μm 微孔滤头过滤除菌，-80 ℃保存备用。

取200 μL 九香虫水提液于1.5 mL EP 管中，加入800 μL 甲醇，再加入5 μLL-2-氯苯丙氨酸（1 mg／mL 溶于纯水中）作为内标，涡旋30 s，于-20 ℃下静置10 min，冰水浴中超声5 min，12 000×g离心15 min，小心吸取上清液400 μL，在真空干燥仪中干燥，向干燥后的物质加入甲氧胺盐试剂（甲氧胺盐酸盐溶于吡啶中，20 mg／mL），轻轻混匀后放入80 ℃烘箱中孵育30 min，向每个样品中加入BSTFA（含有1% TMCS），将混合物在70 ℃下孵育1.5 h，随机作上机检测。

1.4.2 分析条件

1.4.2.1 GC DB-5MS 毛细管色谱柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；载气高纯度氦气，前进样口体积流量3 mL／min；柱体积流量1 mL／min；进样量1 μL；初始温度50 ℃，持续1 min，然后以10 ℃／min的速率上升到310 ℃，保持8 min。

1.4.2.2 MS 前进样口、传输线和离子源温度280、280、250 ℃；离子源EI；电子能量70 eV；质谱数据在全扫描模式下获得，质量扫描范围m／z50～500。

1.4.3 Bradford 法测蛋白含有量 用纯水将蛋白对照品BSA 稀释成0、0.125、0.250、0.500、0.750、1、1.500 mg／mL，分别取5 μL 蛋白对照品、九香虫水提液加入96 孔板，各孔加入250 μL考马斯亮蓝G250 染色液，每组重复5 次。酶联免疫检测仪测定595 nm 波长处吸光度，根据标准曲线计算样品蛋白浓度。

1.4.4 SDS-PAGE 电泳分析 取100 μL 水提液，加入25 μL 蛋白上样缓冲液（5×），于沸水中加热15 min，6 000×g离心1 min，取上清液。SDSPAGE 凝胶由12% 分离胶和5% 浓缩胶组成。取20 μL上清液（蛋白质量浓度0.843 mg／mL）和8 μL 蛋白对照品（上海碧云天生物技术有限公司）加到凝胶加样孔中进行电泳，样品重复4 次。电压80 V 下电泳30 min，再调整为110 V 继续电泳90 min，直至溴酚蓝迁移至凝胶底部1 cm 左右时停止，取出凝胶，放入考马斯亮蓝R250 染色液中染色2 h，再取出，放入脱色液中脱色8 h，每隔1 h更换脱色液，直至色带清晰，通过凝胶成像系统拍照分析。

1.4.5 人乳腺癌细胞及小鼠乳腺癌细胞4T1 培养 人乳腺癌HCC-1937 与小鼠乳腺癌4T1 细胞使用含10%胎牛血清（FBS）、1%青链霉素混合液的RPMI-1640 培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养；人乳腺癌MDA-MB-453 使用含10% FBS、1%青链霉素混合液的L-15 培养基，置于37 ℃、空气相培养箱中培养，每隔48 h 换液，细胞铺满至细胞培养瓶底部80%时进行传代，取对数生长期的细胞进行实验。

1.4.6 九香虫水提液对乳腺癌细胞增殖的抑制作用 使用0.25%胰酶消化处于对数生长期的MDAMB-453、HCC-1937、4T1 细胞，调整细胞浓度为1×105／mL，分别接种于96 孔培养板中，每孔100 μL，设置实验组、无药对照组（细胞组）及空白对照组。用对应培养基将九香虫水提液稀释成质量浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g／mL（生药比），并用0.22 μm 微孔滤头过滤除菌，24 h后弃旧培养液，加入梯度水提液，每个质量浓度设5个复孔。药物作用48 h 后，倒置相差显微镜拍摄细胞形态图，每孔加MTT（5 g／L）20 μL，继续培养4 h 后吸去培养液，每孔加200 μL 二甲基亚砜，恒温摇床振荡10 min 以彻底溶解紫色结晶，酶标仪在570 nm 波长处检测光密度（OD），每组实验重复3 次。计算细胞增殖率，公式为增殖率＝［（OD实验组-OD空白组）／（OD无药组-OD空白组）］×100%，并计算半数抑制浓度（IC50）。

1.4.7 九香虫水提液对小鼠乳腺癌细胞4T1 迁移的影响 取对数生长期的4T1 细胞，用胰酶消化并接种于24 孔板（4×104／孔），置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。待细胞生长90%融合时，用RPMI-1640 培养液稀释九香虫水提液，加药质量浓度分别为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g／mL，每个质量浓度4 个复孔。培养24 h 后，用200 μL移液枪枪头沿每个孔的中轴划痕，无菌PBS 洗涤3次，加培养液培养，分别在0、24 h 用倒置相差显微镜拍照，观察各组细胞迁移情况，并采用Image J、SPSS 17.0 软件对实验结果进行统计分析。细胞迁移率＝ ［（划痕宽度0h-划痕宽度24h）／划痕宽度0h］×100%。

1.5 数据处理 通过SPSS 17.0 软件进行单因素方差分析，所有数据以（±s）表示。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 GC-MS 测定 通过ChromaTOF 软件对质谱数据进行峰提取、基线矫正、解卷积、峰积分等处理［19］，离子流色谱图见图1，再使用LECO-Fiehn Rtx5 数据库，包括质谱匹配及保留时间指数匹配，对物质进行定性分析，峰面积归一化法得出各成分相对含有量。根据数据库匹配相似性≥800，筛选相对含有量较高的20 个化合物，见表1。

图1 九香虫水提液GC-MS 总离子流图Fig.1 GC-MS total ion current chromatogram of aqueous extract from A.chinensis

2.2 九香虫水提液蛋白含有量测定 根据不同浓度牛血清白蛋白对照品溶液（BSA）的平均光密度，绘制蛋白标准曲线，方程为Y＝0.22X+0.54（R2＝0.948 6）。根据标准曲线和九香虫水提液平均光密度值（0.726），测得九香虫水提液蛋白含有量为0.843 mg／mL，RSD 为5.234%。

2.3 九香虫水提液蛋白组成 从SDS-PAGE 电泳图中可见电泳谱带清晰，重复性好，九香虫水提液主要蛋白分子量约为75、35、30、25、12 kDa，蛋白组成较丰富。见图2。

2.4 水提液对乳腺癌细胞增殖抑制的作用 不同浓度九香虫水提液作用于乳腺癌MDA-MB-453 细胞48 h 后，通过细胞形态图比较和MTT 法检测九香虫水提液对MDA-MB-453 细胞的增殖作用。结果，实验组细胞皱缩，体积变小，细胞贴壁能力降低，漂浮细胞较多，对照组细胞呈饱满的圆形，贴壁细胞数量较多，细胞轮廓清晰。见图3。

MTT 显示，九香虫水提液可显著抑制MDA-MB-453、HCC-1937 及4T1 细胞的生长。HCC-1937 细胞对九香虫水提液较为敏感（IC50为0.059 g／mL），MDA-MB-453 次之（IC50为0.142 g／mL），4T1 细胞耐受性最强（IC50为0.190 g／mL），表明九香虫水提液具有抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-453、HCC-1937 及小鼠乳腺癌细胞4T1 增殖的作用，且呈浓度依赖性。见图4～6。

图2 九香虫水提液SDS-PAGE 电泳图谱Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis of aqueous extract from A.chinensis

图3 九香虫水提液作用48 h 对MDA-MB-453 细胞形态的影响（×200）Fig.3 Effects of aqueous extract from A.chinensis on the morphology of MDA-MB-453 cells for 48 h（×200）

图4 九香虫水提液作用48 h 对MDA-MB-453 细胞增殖的影响Fig.4 Effects of aqueous extract from A.chinensis on the proliferation of MDA-MB-453 cells for 48 h

图5 九香虫水提液作用48 h 对4T1 细胞增殖的影响Fig.5 Effects of aqueous extract from A.chinensis on the proliferation of 4T1 cells for 48 h

2.5 不同浓度水煎液对4T1 细胞迁移的影响 通过4T1 划痕实验观察细胞愈合情况，发现对照组迁移距离大于实验组，表明九香虫水提液能够抑制4T1 细胞的迁移能力。另外，对照组4T1 细胞迁移率为59.28%，0.02、0.04、0.06、0.08 g／mL 水提液作用于4T1 细胞24 h 后迁移率分别为54.37%、32.42%、29.78%、14.53%，但0.1 g／mL水提液作用于4T1 细胞24 h 后，大量细胞漂浮，无法测得迁移率。见图7～8。

图6 九香虫水提液作用48 h 对HCC-1937 细胞增殖的影响Fig.6 Effects of aqueous extract from A.chinensis on the proliferation of HCC-1937 cells for 48 h

3 结论与讨论

图7 九香虫水提液作用0、24 h 对4T1 细胞迁移的影响（×40）Fig.7 Effects of aqueous extract from A.chinensis on the migration of 4T1 cells for 0 h and 24 h（×40）

图8 九香虫水提液作用24 h 对4T1 迁移的影响Fig.8 Effects of aqueous extract from A.chinensis on the migration of 4T1 cells for 24 h

乳腺癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一，发病率居于女性肿瘤疾病之首［20］。随着对乳腺癌认识的逐步深入，乳腺癌治疗的观念也正在转变。传统的乳腺癌治疗方式主要包括手术、化疗、放疗以及内分泌治疗，其中化疗药物在治疗癌症中起了很大作用，但不良反应较大，给患者造成了极大的痛苦，寻找不良反应低，又可以抑制肿瘤细胞生长，促进其凋亡的非细胞毒性药物成为研究的重要方向。中医药治疗癌症受到中外学者的广泛重视，发掘传统中医药资源，已成为我国抗肿瘤新药筛选研究的重点之一［21］。九香虫作为传统中药，其药用价值越来越受到重视。GC-MS 分析结果显示，九香虫水提液中含有量较多的物质有L-苹果酸、核糖、乳糖酸、棕榈酸、丝氨酸、硬脂酸等物质。研究表明，L-苹果酸具有抗氧化和抗疲劳的功能［22］；L-核糖进入生物体合成L-核糖核酸［23］，后者可干扰病毒或者肿瘤细胞DNA 合成，影响核酸转录过程，抑制蛋白合成，达到抑制肿瘤的作用［24］；丝氨酸广泛参与人体内细胞和组织结构和功能蛋白的合成［25］；棕榈酸可诱导胰腺癌细胞AR42 J 凋亡［26］；肌酐可抑制胃癌BGC-823 细胞株酵解活性，阻断肿瘤细胞的主要能量来源［27］。九香虫水提液主要成分为糖类、氨基酸、脂肪酸类物质，未发现对人体有害物质，但其在体内作用的安全性仍需进一步实验明确。

本实验所用的HCC-1937 细胞是高转移和高侵袭性的三阴性人乳腺癌细胞［28］，即雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、人类表皮生长因子受体-2（HER-2）均为阴性的人乳腺癌细胞。MDAMB-453 细胞是成纤维细胞生长因子-1（FGF-1）受体过表达、HER-2 阳性、PR 和ER 阴性的人乳腺癌细胞［29-30］，对于不同类型的乳腺癌细胞，九香虫水提液均具有抑制其增殖的作用。4T1 为高转移和高侵袭的三阴性小鼠乳腺癌细胞［31］，乳腺癌4T1 移植瘤模型细胞生长和远处转移与人类乳腺癌Ⅳ期非常相似［32］，为便于后期构建乳腺癌动物模型，探究九香虫水提液对小鼠乳腺癌的体内抗肿瘤作用，本研究检测了九香虫水提液对小鼠乳腺癌4T1 细胞增殖及迁移的影响，结果显示，九香虫水提液能显著抑制4T1 细胞的增殖与迁移，以期为九香虫的深层次开发利用提供参考。