非小细胞肺癌晚期患者常见中医证型淋巴细胞亚群表达的差异

吴姗姗 王柏山 张宁 张程 张艺凡 严峰 李志静

(辽宁中医药大学附属医院临床检验中心,辽宁 沈阳 110032)

在过去的10年全国范围内肺癌的发病率和死亡率都位居肿瘤疾病的榜首。肺癌早期阶段无显著的临床特点，而且没有特异性较强的检查手段〔1〕。大多数肺癌患者在确诊时已处于晚期，严重影响患者的疗效和预后。肺癌病理分型可分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，SCLC通常被认为是神经内分泌来源，占肺癌发病率的15%左右〔2〕，NSCLC包括鳞癌、腺癌和大细胞肺癌等,占肺癌发病的绝大多数。中医并无“肺癌”专病,但咳嗽、咯血、胸痛及肺积等多属于肺癌范畴。《医宗必读》记载“积之成也，正气不足，而后邪气踞之”。《素问·评热病论》记载“邪之所凑，其气必虚。”中医学认为肺癌是由于机体正气虚损，阴阳失衡，邪毒乘虚袭肺，邪滞胸中，宣降失司，气机不畅，气血瘀滞，津液输布不利，津聚为痰，痰瘀胶结日久所致。肺癌是因虚而得病，因虚而致实。现代医学认为肺癌的发生发展是多基因、多因素、多阶段共同参与的复杂过程，目前T细胞和自然杀伤(NK)细胞是公认的能够有效监督和清除肿瘤细胞的细胞。但是越来越多的证据表明B细胞在调节T细胞应答对抗肿瘤方面也发挥非常关键的作用〔3〕。因此肺癌的发生、发展及预后与机体的免疫功能有着密不可分的关联。本研究探讨NSCLC晚期患者常见中医证型的T细胞亚群、NK细胞及B细胞的差异。

1 材料与方法

1.1研究对象 本研究通过医院伦理委员会审批及患者的知情同意。选择辽宁中医药大学附属医院2017年1～5月期间收治的有病理学明确诊断的NSCLC晚期患者101例，其中男48例，女53例；年龄42～80岁，平均(53.5±3.7)岁，其中病理学诊断NSCLC 101例(鳞癌45例，腺癌56例)；TNM分期Ⅲb期71例，Ⅳ期30例。入选标准：①患者符合原发性NSCLC诊断标准〔4〕且无其他肿瘤史；②患者不伴发自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、风湿性骨关节病等；③患者未服用激素类药物或接受免疫抑制剂的治疗；④除外活动性(病毒)感染〔5〕。选择与患者性别年龄相匹配的健康人23例即健康对照(NC)组，其中男12例，女11例；年龄40～77岁，平均(52.3±2.8)岁。中医辨证分型标准参考“十一·五”国家级规划教材《中医内科学》〔6〕，将肺癌分为4个临床证型即气阴两虚、阴虚痰热、痰湿蕴肺和气血瘀滞。其中气阴两虚36例、阴虚痰热19例、痰湿蕴肺21例和气血瘀滞25例。主要症候：①气血瘀滞型。咳嗽不畅、胸痛如锥刺，痛有定处，或胸闷气急，或痰血暗红，便秘口干，口唇紫暗。舌暗红或紫暗，有淤斑、瘀点，苔薄，脉细涩或弦细等；②痰湿蕴肺型。咳嗽，咯痰，气憋，痰质稠黏，痰白或黄白相兼，胸闷胸痛，纳呆便溏，神疲乏力，舌质淡，苔白腻，脉滑；③阴虚痰热 咳嗽无痰或少痰，或痰中带血，甚则咯血不止，胸痛，心烦寐差，低热盗汗，或热势壮盛，久稽不退，口渴，大便干结，舌质红，舌苔黄，脉细数或数大；④气阴两虚。咳嗽少痰，或痰中带血，咳声低怯，气短，自汗或盗汗，恶风，口干不欲多饮，舌质淡红，或舌质红有齿印，苔薄白，脉细弱。

1.2主要试剂和仪器 BD公司的FACS Calibur流式细胞仪、Tritest CD4 FITC/CD8 PE/CD3 PerCP 试剂、Tritest CD16CD56 PE/CD3 FITC/CD19 APC试剂、10×免洗溶血素。

1.3实验方法 T细胞亚群、NK细胞和B细胞的检测 具体步骤如下:患者清晨空腹采集2 ml外周静脉全血选择乙二胺四乙酸二钾(EDTA)抗凝，将20 μl的CD4 FITC/CD8 PE/CD3 PerCP试剂和CD16CD56 PE/CD3 FITC/CD19 APC试剂分别加入不同的流式管中，再加入25 μl EDTA 抗凝血，涡旋振荡混合均匀，室温避光15 min后，加入经10倍稀释的免洗溶血素(BD公司)450 μl，继续室温避光15 min，样本溶血充分后流式细胞FACSCalibur(BD公司)检测，MULTISET软件进行分析。

1.4统计学处理 采用SPSS20.0软件进行Mann-WhitneyU检验、Spearman 秩相关检验。

2 结 果

2.1NSCLC晚期患者常见中医证型T细胞亚群、NK细胞及B细胞的表达 CD3+T细胞表达水平：气阴两虚<阴虚痰热<痰湿蕴肺<气血瘀滞0.05)；NK细胞(CD16+CD56+)表达：NC=气血瘀滞<阴虚痰热<痰湿蕴肺<气阴两虚，其中NC组、气血瘀滞组显著低于气阴两虚组、痰湿蕴肺组(P<0.05)。CD19+B细胞亚群表达：痰湿蕴肺

表1 各中医证型不同淋巴细胞亚群的比较〔%，M(Q25，Q75)〕

与NC组比较：1)P<0.05，与气血瘀滞组比较：2)P<0.05，与痰湿蕴肺组比较：3)P<0.05，4)P<0.01

2.2NSCLC晚期患者中医辨证分为虚证组(气阴两虚和阴虚痰热组)和实证组(痰湿蕴肺和气血瘀滞组)，T细胞亚群、NK细胞及CD3-CD19+B细胞的表达 T细胞表达：虚证组CD3+T细胞表达显著低于实证组、NC组(均P<0.05)。虚证<实证0.05)。NK细胞(CD16+CD56+)表达：NC<实证<虚证，其中虚证组和实证组NK细胞表达无显著差异，但是虚证组显著高于NC组(P<0.05)。虚证组、实证组和NC组的CD19+B细胞表达无显著差异(P>0.05)。见表2。

表2 虚证组和实证组不同淋巴细胞亚群的比较〔%，M(Q25，Q75)〕

与虚证组比较：1)P<0.05

2.3NSCLC晚期患者的相关性分析 CD3+T细胞表达百分比与CD8+T细胞表达百分比呈正相关(r=0.37，P<0.01)；CD3+T细胞表达百分比与NK细胞表达百分比呈负相关(r=-0.80，P<0.01)，；NK细胞表达百分比与CD4+T细胞表达百分比呈负相关(r=-0.45，P<0.01)，见图1。

3 讨 论

中医定义肺癌是一种全身属虚，局部属实，本虚标实之病证，邪毒聚结，最易耗伤人体正气，随着邪长正消，正气受戕益甚。可见正虚是肺癌的内因,也是推动肺癌发展的关键,扶正培本及时时顾护正气是中医对肺癌进行辨证施治的核心。中医的正气主要由先天的元气和后天的中气构成。有研究发现补中益气之法主要改善非特异性免疫，也能在一定程度上改善特异性免疫〔7〕。中医学的正气理论与现代医学的免疫理论有相通之处但是不能等同，二者的关联有待深入研究。

免疫系统对于肿瘤细胞的识别和清除可发挥免疫监督作用，机体的免疫功能与肿瘤的发生发展有着密切的相关性〔8〕。依据表型和功能不同将淋巴细胞分为不同的淋巴细胞亚群，其中T细胞是细胞免疫的主要效应细胞〔9〕。目前T细胞亚群用于监测肿瘤的发展、判断疗效及预后被普遍认可〔10〕。

李际强等〔11〕研究发现虚证患者的CD3+T细胞显著低于实证组，本研究结果与其一致。CD3+T细胞主要由CD4+和CD8+T细胞构成；CD4+T细胞分泌的细胞因子可以活化单核细胞、巨噬细胞和NK细胞，并诱导上述细胞发生免疫应答吞噬肿瘤细胞〔5〕。我们就此推测气血瘀滞组CD4+T细胞能够更好地刺激单核、巨噬和NK细胞吞噬肿瘤细胞，更好地发挥对肿瘤细胞的免疫监视作用，虚证组的细胞免疫水平显著低于实证组。CD8+T细胞在不同证型均有下降，但是各组间并无显著性差异，CD8+细胞毒性T细胞特异性识别MHC-Ⅰ类分子结合的抗原肽复合物传导活化信号，通过释放颗粒酶和穿孔素裂解靶细胞。Liu等〔12〕研究发现，作为重要的抗击肿瘤的免疫细胞，CD8+细胞毒性T细胞在NSCLC患者的表达较健康人减少但无统计学差异，本研究的结果与之一致。

NK细胞谓之自然杀伤细胞，可以非特异性的杀伤肿瘤细胞，发挥天然性免疫应答的功能〔13〕。之前的研究发现NSCLC晚期患者NK细胞的表达较NC组升高但并无统计学意义〔14〕，本研究结果推测气阴两虚组、痰湿蕴肺组NK 细胞水平升高可能会使患者天然免疫功能增强，但有待于进一步验证NK细胞的功能。本研究结果说明NK细胞表达与CD3+和CD4+T细胞表达是互为消长。当CD4+T细胞发挥的细胞免疫功能受损时NK细胞发挥的天然免疫功能会增强作为补充。

B细胞受抗原刺激后，分化增殖为浆细胞，浆细胞可以产生抗体，进而对免疫稳态发挥调节作用。B细胞还能通过分泌细胞因子和表面特异性的受体来调节其他免疫细胞，例如对T细胞的免疫应答发挥抗原提呈作用。当黑色素瘤或其他实体肿瘤的患者体内CD27+和CD19+B细胞匮乏时，会加速其肿瘤的生长，但是这种现象的机制尚不清楚〔15,16〕。

综上，气血瘀滞组机体的免疫功能优于其他证型。陈永等〔17〕综合国内众多肺癌中医证型的研究分析得出结论，气血瘀滞型常见于Ⅰ期、Ⅱ期肺癌患者。中医理论认为“肺癌一般初起多为邪毒痰瘀壅滞于肺，侧重实证，虚损不明显，机体正气尚强，若失治，邪毒伤正，肺脾气虚，遏邪乏权，则邪毒可乘虚流窜并驻留于脏腑等处，虚损加重，耗气伤血，伤阴损阳，而导致“气阴两虚”的难治境地”。说明气血瘀滞型的免疫功能尚未发展到受到重创而失去对肿瘤细胞发挥监督作用的程度，所以气血瘀滞型的预后较其他证型更好，本研究结果也印证了这一点，再一次表明传统医学与现代医学是有共识的。中医学的正气理论与现代医学的免疫理论的关联有待深入研究。