唑尼沙胺对PS1/APP小鼠学习记忆功能和前额叶皮层中BDNF和TrkB的影响

周儒奎 刘晋芳 杨李旺 牛晓军 储开博 武赟 翟晓艳

(山西中医药大学基础医学院，山西 晋中 030621)

阿尔茨海默病(AD)是一种在老年人群中经常出现的神经退行性疾病，其主要的临床特征是渐进性发展的认知功能障碍，特别是进行性记忆功能受损，最终导致痴呆〔1〕。脑源性神经营养因子(BDNF)是一种对学习和记忆功能极其重要的神经营养因子〔2〕，通过连接它的主要受体酪氨酸激酶受体(Trk)B在神经元的生长、生存、分化过程中发挥重要作用，维持神经元的正常功能和突触可塑性，从而维护中枢神经系统的正常功能，而在AD患者大脑皮层和海马中BDNF和TrkB的表达减少，参与了AD的记忆功能缺陷病理机制中〔3，4〕。

唑尼沙胺(ZNS)可以通过血脑屏障到达神经系统，一直以来作为一种抗癫痫的药物来使用并且没有什么副作用〔5〕，同时ZNS可以改善帕金森病患者的主要症状〔6〕。研究表明ZNS可以通过抑制小胶质细胞的活性和抗氧化作用起到神经保护作用〔7〕，在周围神经损伤研究中发现，ZNS可以通过促进BDNF和TrkB的表达，来促进运动神经元神经突伸长和轴突的再生〔8〕。目前关于ZNS对AD中BDNF和TrkB的变化调节来改善学习记忆功能的研究国内外尚未见报道，本实验拟观察对PS1/APP小鼠学习记忆功能和前额叶皮质BDNF和TrkB的影响，探讨ZNS在AD治疗中的可能作用及作用机制。

1 材料和方法

1.1材料 Morris水迷宫设备(中国医学科学院研制)；ZNS(TCI上海化成有限公司)；绵羊多克隆BDNF抗体、兔多克隆TrkB体(Abcam司)，小鼠多克隆GAPDH抗体(中杉金桥公司)，HRP标记兔抗绵羊IgG(康维生物公司)，HRP标记山羊抗兔IgG(中杉金桥公司)，蛋白酶抑制剂(Sigma-Aldrich公司)，蛋白裂解液、BCA试剂盒、ECL Plus发光液(碧云天生物公司)，DAB染色剂(中杉金桥生物公司)。

1.2实验动物及分组 PS1/APP双转基因小鼠14只和野生C57L/6J小鼠7只，体重20～30 g，6月龄，小鼠饲养在24℃左右通风良好的房间，维持相对湿度在60%左右，每天12 h光照环境，给予清洁的饮水和饲料，14只PS1/APP小鼠随机平均分为两组，分别为生理盐水(PS1/APP-veh)组、ZNS(PS1/APP-ZNS)组，7只野生C57/BL6J小鼠作为野生生理盐水(WT-veh)组，给药采取腹腔注射，分别每天注射20 mg/kg生理盐水、20 mg/kg ZNS、20 mg/kg生理盐水，所有小鼠加药4 w。

1.3Morris水迷宫行为学测试

1.3.1定位航行实验 在加药4 w后，利用水迷宫评估小鼠的空间记忆，先做定位航行试验测试，其中环状水池，黑色，水池划分为四个象限，在第二象限放置直径为8 cm的平台，注水，将水温调节在(24±1)℃，使水位高于平台2 cm。设置每次检测的时间为60 s，小鼠放入水中时，面向箱壁边缘，60 s内让小鼠在水下寻找平台，当小鼠寻找到平台并在平台逗留超过2 s后，录像自动停止，记录下每只小鼠的潜伏期时间(从入水至停留到平台的时间)，当小鼠在水下寻找平台时间超过60 s时，人为地引领小鼠至平台，继续让小鼠在平台上逗留大约10 s，记录时间为60 s。每天让每只小鼠先后依次从划分的四个象限固定位置入水，持续5 d，撤去平台。

1.3.2空间探索实验 第6天测试时，从水迷宫中取出水下的平台，让小鼠从第四象限入水，让其在水中游泳60 s，记录小鼠游过原先放置平台位置的次数。

1.4免疫组化检测BDNF和TrkB在前额叶的表达 各组小鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉，左心室注射4%多聚甲醛灌流固定，取出脑组织，放于4%的多聚甲醛中过夜固定，再依次用20%蔗糖溶液、25%蔗糖溶液、30%蔗糖溶液处理后，使用恒冷冰冻切片机切片，厚度为7 μm，切好的冰冻切片置于-20℃冰箱保存备用。切片在室温放置1 h，用过氧化物酶室温孵育10 min，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次；分别用兔血清和山羊血清孵育各组切片15 min，弃血清，滴加羊BDNF抗体和兔TrkB抗体，浓度均为1∶100，4℃过夜；次日PBS洗3次，各组切片分别滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗羊二抗和羊抗兔二抗，室温孵育15 min，PBS洗3次，滴加生物链霉素，室温孵育15 min；二氨基连苯胺(DAB)呈色，PBS水洗，常规脱水、透明，用中性树胶封片。

1.5Western印迹检测BDNF和TrkB在前额叶皮层的表达 各组小鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，小鼠断头取脑，分离出前额叶皮层；将前额叶皮层置于装有蛋白裂解酶和蛋白酶抑制剂的离心管中，超声粉碎后放于4℃过夜，次日4℃ 12 000 r/min离心30 min，取上清；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量；煮样，分装、-80℃冻存备用；等量样品加入到8%十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶中，转移至聚偏氟乙烯 (PVDF) 膜，将膜放入5%小牛血清(BSA)封闭2 h后，按蛋白分子量裁膜，加入1∶1 000稀释的兔多克隆TrkB抗体、1∶2 000稀释的羊多克隆BDNF、1∶2 000稀释的兔多克隆GAPDH，放于4℃冰箱过夜，TBST洗膜后，加入相应经稀释1∶5 000 HRP标记的羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G和兔抗羊IgG，37℃孵箱孵育2 h后，TBST洗膜，经电化学发光(ECL)，Bio-Rad凝胶成像系统采图，Image J软件分析。

1.6统计学分析 采用SPSS22.0软件进行t检验，方差分析。

2 结 果

2.1Morris水迷宫行为学测试结果 在定位航行试验中，随着训练次数增加，各组小鼠找到水下平台的时间缩短，PS1/APP-veh组小鼠较WT-veh组小鼠需消耗更长时间找到水下平台(P<0.05)；PS1/APP-ZNS组较PS1/APP组小鼠找到水下平台的时间缩短(P<0.05)；空间探索试验中，PS1/APP-veh组小鼠较WT-veh组小鼠穿越原平台位置次数减少(P<0.05)；PS1/APP-ZNS组小鼠较PS1/APP-veh组小鼠穿越原平台位置次数增加(P<0.05)。见表1。

表1 各组不同时间水迷宫行为学测试结果比较

与WT-veh组比较：1)P<0.05；与PS1/APP-veh组比较：2)P<0.05，下表同

2.2免疫组化分析BDNF蛋白和TrkB蛋白在前额叶皮层的表达 镜下观察到WT-veh组前额叶区BDNF和TrkB阳性反应产物呈棕褐色，与WT-veh组相比，PS1/APP-veh组BDNF和TrkB阳性反应产物着色变浅，阳性细胞数减少，积分光密度明显减少(P<0.05)；与PS1/APP-veh组相比，PS1/APP-ZNS组BDNF和TrkB的阳性反应产物变深，阳性细胞数增多，积分光密度明显增多(P<0.05)。该实验证实PS1/APP小鼠较正常小鼠前额叶皮层中出现BDNF和TrkB水平的下降，注射ZNS可以促进PS1/APP小鼠前额叶皮层中BDNF和TrkB的表达。见图1，表2。

箭头表示阳性细胞图1 各组前额叶中BDNF与TrkB的表达(免疫组化，×200)

表2 各组前额叶中BDNF与TrkB积分光密度比较

2.3Western印迹方法观察前额叶皮层BDNF蛋白和TrkB蛋白表达 PS1/APP-veh组较WT-veh组前额叶皮层中BDNF和TrkB水平减少(P<0.05)，PS1/APP-ZNS组较PS1/APP-veh组前额叶皮层中BDNF和TrkB水平增多(P<0.05)。该实验也证实PS1/APP小鼠中较正常小鼠前额叶皮层中BDNF和TrkB水平的下降，注射ZNS可以促进PS1/APP小鼠前额叶皮层中BDNF和TrkB的表达。见表3，图2。

1～3：WT-veh组、PS1/APP-veh组、PS1/APP-ZNS组图2 Western印迹显示各组前额叶中BDNF和TrkB的表达

表3 各组前额叶中BDNF与TrkB蛋白表达比较

3 讨 论

AD主要的表现是学习记忆功能衰退和其他认知能力的下降，并且病人通常伴有一定程度的精神和行为障碍〔9〕。PS1/APP小鼠能够模拟AD的主要病理生理机制，出现相似的学习记忆功能障碍等症状，是公认的比较好的AD模型〔10〕。

ZNS主要通过抑制钠离子通道和T型钙通道、间接抑制谷氨酸受体的活性从而增强抑制型神经递质γ-氨基丁酸(GABA)的释放来起到抗癫痫的作用〔11〕，在帕金森病中ZNS可以对多巴胺细胞起到神经保护作用〔12，13〕，在脑损伤中ZNS也可以起到神经保护的作用〔14〕，在周围神经损伤研究中发现，ZNS可以通过促进BDNF和TrkB的表达来促进运动神经元神经突伸长和轴突的再生〔15〕。

在大脑发育过程中，BDNF作为一种生长因子，能够促进神经元突触中轴突、树突的生长和成熟，有利于增强突触的可塑性，在学习和记忆过程中起到重要的促进作用〔16〕。BDNF通过与TrkB作用，激活三大信号通路，包括增殖蛋白激酶-细胞外调节蛋白激酶(MEKs-ERK)、磷酯酶Cγ1-三磷酸肌醇/二酰基甘油(PLCγ1-IP3/DAG)和磷脂酰基醇激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)通路，这些通路对突触生长和突触的可塑性有重要作用〔17，18〕。BDNF通过增加神经元树突棘的数目和大小促进轴突的形成，BDNF与TrkB结合，可以激活ERK和PI3K途径，促进突触相关蛋白突触小泡蛋白(SYP)、生长相关蛋白(GAP)-43和突触后致密蛋白(PSD)95的表达〔19〕。Marchetti〔20〕认为BDNF和TrkB的减少会降低突触可塑性，损伤神经元，是前额叶皮层和海马退行性变化的主要原因。前额叶皮层是人类大脑高级认知活动相关的关键区域，在注意力、情绪调节、学习记忆过程和思维推理中起重要作用〔21〕。向AD小鼠模型注入BDNF可以改善前额叶皮层和海马的退行性变化和改善其学习和记忆功能〔22〕。

本研究结果表明ZNS可以通过促进前额叶皮层内BNDF和TrkB的表达，有利于突触相关蛋白的表达和增强突触的可塑性，从而改善PS1/APP小鼠中的学习和记忆功能。