茯苓四逆汤对老年脓毒症大鼠心肌损伤的保护作用

王评 彭晓洪 黄永莲 黄亚秀 李少萍 陈冬杰 胡世平

(深圳市龙岗区中医院重症医学科，广东 深圳 518172)

脓毒症是重症监护病房患者的主要死亡原因〔1〕。受基础病、免疫力低下等因素影响，老年人较青壮年更易发生脓毒症，且预后更差〔2〕。脓毒症易继发心肌损伤，心肌损伤越重，脓毒症死亡率越高，两者呈显著正相关〔3〕。目前多认为Toll样受体(TLR)介导的炎症反应与脓毒症心肌损伤相关，其下游信号通路中核转录因子(NF)-κB、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6等促炎因子在发病过程中起重要作用〔4,5〕。心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)是新发现的极早期诊断心肌损伤的标志物，具有很高的特异性、敏感性，能独立预测脓毒症心肌损伤的预后〔6〕。前期研究发现茯苓四逆汤能减轻慢性心力衰竭患者炎症反应、改善心功能〔7〕。本研究观察茯苓四逆汤对老年脓毒症大鼠血清TNF-α、IL-6浓度及心肌细胞NF-κB、H-FABP蛋白表达的影响，探讨茯苓四逆汤对老年脓毒症大鼠心肌损伤的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1试验动物 115只20月龄SPF级雄性SD大鼠，体重(350±30)g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司〔许可证号：SCXK(沪)2017-0006〕。动物实验通过医院伦理审查，所有大鼠实验前适应性喂养1 w。

1.2主要仪器 Fresco D-37520离心机(赛默飞)；ADVIA240全自动生化分析仪(西门子)；165-8001电泳槽(BIO-RAD)；164-5050电泳仪(BIO-RAD)；170-3930转印槽(BIO-RAD)；TS-1000水平脱色摇床(海门其林贝尔)；MultiSkan3酶标仪(Thermo)；Pro 200精密组织匀浆器(Pro Scientific)等。

1.3试剂 大鼠TNF-α、IL-6酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海美轩生物科技有限公司，货号分别为MEXN-R0019、MEXN-R0015)；Western印迹试剂:兔抗大鼠NF-κB抗体、兔抗大鼠H-FABP抗体及内参Gapdh单抗(Abcam，英国，货号分别为AB32536、AB45966、Ab8245)，二抗、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒、RIPA裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)等。茯苓四逆汤(茯苓30 g、熟附子10 g、人参5 g、干姜8 g、炙甘草10 g)由医院药剂科提供(深圳市正皇庄中药饮片有限公司配送)，浓煎成含原生药1 g/ml，过滤除菌分装4℃保存备用。

1.4分组及造模 采用随机数字表法将大鼠分为6组：正常组15只，假手术组、模型组、茯苓四逆汤低、中、高剂量组各20只。参考文献〔8〕采用盲肠结扎穿孔术制备脓毒症模型：术前12 h禁食，自由饮水。腹腔注射0.4 ml/kg 10%水合氯醛麻醉，腹部备皮消毒，全身75%酒精擦拭消毒后放入超净工作台并固定于手术台。沿剑突下约2 cm处沿腹正中线剪开腹壁约1 cm，找出盲肠，用5号线结扎约1/3盲肠，用18G针头贯通穿刺结扎部位的盲肠2次，轻轻挤压使少量肠内容物溢出，将处理好的盲肠回纳腹腔，缝合腹腔。术毕予颈后皮下注射10 ml生理盐水液体复苏，同时将大鼠置于37℃加热板上等待苏醒。假手术组开腹，除盲肠结扎及穿刺，余同模型组。正常组不进行麻醉及开腹手术。

1.5给药方法 大鼠苏醒后自由饮水正常进食，单独饲养。茯苓四逆汤灌胃剂量参照血清药理学等效剂量换算公式进行换算〔9〕，350 g大鼠的等效剂量折算为2.1 g，低、中、高剂量分别为1倍(2.1 g/d)、2倍(4.2 g/d)、3倍(6.3 g/d)，用生理盐水稀释至10 ml，造模后6 h开始灌胃，每日剂量分2次给药，持续3 d，正常组、假手术组及模型组相同时间点给予等量生理盐水灌胃。

1.6观察指标 每天观察大鼠的生存状态和生存时间、死亡数。各组于造模后24 h、48 h、72 h分别随机取5只处死收集尾静脉血，离心分离血清后采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测TNF-α、IL-6含量，操作步骤严格按照说明书进行。Western印迹检测NF-κB、H-FABP蛋白表达：采血后处死取心脏，将心肌组织液氮速冻后切成细小碎片，加入RIPA裂解液，用匀浆机研磨研碎，充分裂解后，12 000 r/min离心5 min，取上清。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。经灌胶、电泳、电转、封闭后分别与NF-κB、H-FABP及GAPDH的一抗(抗体滴度分别为1∶1 000，1∶5 000)和辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(Jackson 1∶5 000)作用，最后采用化学发光法检测目的条带，用凝胶成像仪拍照并测定各显色条带的灰度值。

1.7统计学方法 采用SPSS21.0软件进行χ2检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1一般情况比较 造模后正常组饮食活动无改变，假手术组术后饮食、活动量下降，后逐渐恢复正常；模型组及中药各组均出现精神萎靡、进食减少、呼吸增快、被毛蓬松、少动、大便稀溏等症状，中药各组24 h后症状逐渐改善，改善程度好于模型组，且随着中药剂量增大症状改善越明显；造模后72 h，模型组共死亡5只，死亡率25.0%，中药各组共死亡3只(其中低剂量组死亡2只，中剂量组死亡1只，高剂量组无死亡)，死亡率5.0%，假手术组、正常组无死亡，中药各组总死亡率显著低于模型组(P<0.05)。

2.2血清TNF-α、IL-6比较 正常组、假手术组血清TNF-α、IL-6水平无显著差异(P>0.05)；模型组血清TNF-α、IL-6水平持续升高，48 h后下降，较正常组同时间点均明显升高(P<0.01)；中药各组血清TNF-α、IL-6水平24 h后逐渐下降，较正常组同时间点均明显升高(P<0.05，P<0.0,1)；中药各组血清TNF-α、IL-6水平同时间点均显著低于模型组(P<0.01，P<0.05)，且高剂量组降低更明显；低、中剂量组血清TNF-α、IL-6水平比较无显著差异(P>0.05)，高剂量组上述指标同时间点均较低剂量组显著下降(P<0.05)。见表1。

表1 各组造模后不同时间点血清TNF-α、IL-6水平比较

与正常组比较:1)P<0.05,2)P<0.01；与模型组比较:3)P<0.05，4)P<0.01；与低剂量组比较:5)P<0.05；与24 h比较：6)P<0.05下表同

2.3各组心肌细胞NF-κB、H-FABP蛋白表达比较 正常组、假手术组心肌NF-κB、H-FABP蛋白表达无显著差异(P>0.05)；模型组NF-κB、H-FABP蛋白表达随时间升高，48 h达峰值，较正常组同时间点明显升高(P<0.01)；中药各组上述指标24 h后回调，高剂量组24 h、48 h NF-κB、H-FABP蛋白表达显著高于正常组(P<0.05，P<0.01)，72 h无显著差异(P>0.05)，低、中剂量组各指标同时间点均显著高于正常组(P<0.05，P<0.01)；中药各组NF-κB、H-FABP蛋白表达较模型组同时间点均显著下降(P<0.01，P<0.05)；低、中剂量组各指标同时间点比较无显著差异(P>0.05)，高剂量组48 h、72 h NF-κB、H-FABP蛋白表达显著低于低剂量组(P<0.05)。见表2。

表2 各组心肌细胞NF-κB、H-FABP变化

3 讨 论

研究表明〔10〕，脓毒症的发病率及死亡率随着年龄增长而升高，65岁以上人群脓毒症罹患相对危险度是青壮年的13.1倍，老年脓毒症患者的住院死亡率及1年累计死亡率均高于非老年患者。心脏是脓毒症常见受损器官，脓毒症心肌损伤所致心力衰竭患者的死亡率高达70%〔11〕。肌钙蛋白(cTn)I是心肌损伤传统的特异性标志物。脓毒症心肌损伤4～6 h后cTnI已普遍升高，并发心力衰竭的升高更明显，其升高程度与死亡率密切相关〔12〕。cTnI不能反映超早期心肌损伤情况。H-FABP是心肌细胞内特有的一种小分子蛋白质，当心肌细胞缺血、缺氧时迅速释放入血，血清水平在1～3 h升高，4～8 h达峰值，12～24 h恢复正常〔13〕。研究表明〔14〕，脓毒症患者发病1 h血清H-FABP已明显升高，与病情程度呈正相关，与心功能、生存率呈显著负相关。动物实验证实〔15〕，脓毒症小鼠血清H-FABP升高明显早于cTnI出现，升高程度与心肌损伤病理改变一致。本研究提示老年脓毒症大鼠心肌损伤、心功能障碍持续存在。

脓毒症心肌损伤发病机制复杂，涉及冠脉微血管血流改变、心肌细胞凋亡、内皮功能障碍、线粒体损伤、细胞因子失衡等〔16〕，其中TLR介导的炎症反应学说被广泛认可，其信号通路TLR4/NF-κB/TNF-α、IL-6被认为是脓毒症心肌损伤的主要发病机制之一〔17〕。肠道是脓毒症的关键启动器官。脓毒症时肠黏膜损伤，肠道菌群、内毒素移位入血，形成肠源性内毒性血症，内毒素与TLR4结合并激活单核细胞，随后启动髓样分化因子(MyD88)依赖性/非依赖性通路反应，两者通过不同信号通路最终共同激活胞质中的NF-κB，活化的NF-κB诱导TNF-α、IL-6基因转录，进而合成释放大量炎症因子，最终形成全身炎症反应综合征，导致包括心肌损伤在内的多脏器损伤〔18〕。研究表明〔19〕，炎症反应贯穿于脓毒症心肌损伤疾病始终，炎症反应程度与预后密切相关，抑制炎症是心肌损伤治疗的重要措施。本研究提示脓毒症大鼠炎症反应持续存在，且随着病情进展而加重，这与心肌细胞H-FABP蛋白表达变化趋势一致。可见，炎症反应是心肌损伤的一个重要因素。

脓毒症属于中医学“热病”“温病”等范畴。传统认为正虚毒损，脏腑气机失调是其基本病机，基本治则为清热解毒，兼活血、降浊、通腑等法，延至后期，方予回阳救逆之品。事实是，脓毒症患者多死于休克、心力衰竭等阳气衰微时。《素问·生气通天论》云:“阳气者，若天与日，失其所，则折寿而不彰”。清·郑钦安《医理真传》云:“人之所以立命者，在活一口气乎。气者阳也”。可见阳气乃人体安身立命之根本，只可温养，不可妄加戳戮。《素问·阴阳应象大论》云：“壮火食气……少火生气。”脓毒症常伴高热，必然戳戮阳气，“壮火食气”，若妄投大剂苦寒之品，易致阳气耗散乃至厥脱，终成不治之症。有学者认为脓毒症发病在于正虚，阳气衰微是脓毒症心肌损伤的重要病机，予温阳益气活血类中药取得较好疗效〔20〕。笔者认为，脓毒症心肌损伤为正虚邪实，毒热伤正，心阳耗竭，阳不化气，阴血不生，水湿痰浊瘀血等病理产物丛生，壅滞经络，变证迭起。治以温阳育阴利水为法，方选茯苓四逆汤。茯苓四逆汤出自《伤寒论》，由茯苓、附子、干姜、人参、炙甘草组成。方中重用茯苓健脾利水，人参滋阴益气，附子、炙甘草、干姜合为四逆汤温阳益气，取“少火生气”之意。全方药少量重，直切病机，乃温阳育阴利水代表方。既往发现〔7，21〕，茯苓四逆汤能降低慢性心力衰竭患者血清TNF-α、晚期糖基化终产物浓度，进而改善心功能、提高患者生活质量。本研究提示茯苓四逆汤能明显抑制脓毒症大鼠炎症反应，减少炎症因子表达，随着炎症反应减轻，中药各组心肌细胞H-FABP蛋白表达逐渐降低，表明茯苓四逆汤通过抑制脓毒症大鼠炎症反应进而减轻心肌损伤、改善心功能，上述治疗作用与茯苓四逆汤剂量高低密切相关。