lncRNA PCAT19靶向miR-143-3p通过信号通路PI3K/Akt对甲状腺癌细胞增殖和凋亡的影响及机制

陈超 张伟丽 冯长松

(信阳职业技术学院医学院，河南 信阳 464000)

甲状腺癌是一种常见的内分泌恶性肿瘤，其发病机制复杂，从分子层面研究、了解甲状腺癌的发病机制有助于甲状腺癌患者的个体精准化治疗〔1〕。研究发现长链非编码RNA(lncRNA)在多种类型癌症中的失调表达与癌症的发生发展相关，然而它们在甲状腺癌中的作用和分子机制仍不完全清楚〔2〕。前列腺癌相关转录本(PCAT)是一种lncRNA，PCAT1与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭转移及患者的预后密切相关〔3〕。PCAT19是PCAT家族成员之一，有研究发现长同型PCAT19调节细胞增殖、生长和转移，可通过lncRNA PCAT19驱动前列腺癌的进展〔4〕；此外，PCAT19通过调节miR-182/丙酮酸脱氢酶激酶(PDK)4和代谢平衡促进喉癌细胞的增殖和肿瘤发生〔5〕。研究发现，多种miRNA在不同类型的甲状腺癌中表达异常，表明miRNA可能在甲状腺癌的发生、发展过程中有重要作用〔6〕。研究报道miR-143-3p通过靶向RNA结合蛋白quaking(QKI)-5在食管鳞状细胞癌中调节细胞增殖、侵袭和上皮-间质转化，起到抑制肿瘤的作用〔7〕。miR-143-3p通过调节丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)7的表达抑制人乳腺癌细胞的增殖，迁移和侵袭〔8〕。miR-143-3p在甲状腺乳头癌中下调表达，但作用机制不清楚〔9〕。磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号转导通路是细胞内重要的信号转导通路之一，也是甲状腺癌中一条重要的信号传导通路，与甲状腺癌的发生发展相关〔10〕。有研究发现干扰胰岛素受体底物(IRS)-1通过抑制PI3K/AKT信号通路激活能降低人乳头状甲状腺癌TPC-1细胞的生存能力和转移能力〔11〕。然而PCAT19及miR-143-3p对甲状腺癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制尚不清楚，本实验旨在研究PCAT19及miR-143-3p对甲状腺癌细胞增殖和凋亡的影响及PCAT19是否通过调控miR-143-3p和PI3K/AKT信号通路影响甲状腺癌细胞增殖和凋亡。

1 材料与方法

1.1细胞与主要试剂 甲状腺癌细胞BCPAP、TPC-1、SW1736和正常甲状腺细胞HT-ori3均购自中国科学院上海细胞库；胎牛血清、RPMI-1640培养基购自上海玉博生物科技有限公司；Trizol试剂、SYBR Green荧光定量PCR试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司；二甲基亚砜(DMSO)、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒、磷酸盐缓冲液(PBS)购自上海君瑞生物技术有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；MTT试剂盒、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙锭(Annexin V-FITC/PI)试剂盒购自上海一研生物科技有限公司。

1.2细胞培养 将甲状腺癌细胞BCPAP、TPC-1、SW1736和正常甲状腺细胞HT-ori3置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，在37℃、5% CO2的培养箱中培养，取对数生长期细胞用于后续实验。

1.3细胞转染与分组 取对数生长期甲状腺癌细胞BCPAP，将miR-con、miR-143-3p、si-con、si-PCAT19、pcDNA和pcDNA-PCAT19质粒分别转染至BCPAP细胞中，记为miR-con组、miR-143-3p组、si-con组、si-PCAT19组、pcDNA组和pcDNA-PCAT19组；未进行任何处理的甲状腺癌细胞BCPAP作为对照(NC)组；将si-PCAT19分别与anti-miR-con和anti-miR-143-3p质粒共转染至BCPAP细胞中，分别记为si-PCAT19+anti-miR-con组和si-PCAT19+anti-miR-143-3p组，转染均按照LipofectamineTM 2000试剂盒进行操作。

1.4qRT-PCR检测miR-143-3p和PCAT19表达水平 用Trizol提取细胞总RNA，RNA定量后反转录成cDNA，按照PCR试剂盒以β-actin为内参进行PCR扩增，反应条件：95℃ 5 min；95℃ 20 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40个循环。相对表达量采用2-△△Ct法计算。

1.5Western印迹检测细胞周期蛋白(Cyclin)D1、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cleaved-caspase)-3、磷酸化(p)-AKT、磷脂酰肌醇3-激酶的P110α催化亚基(PI3Kp110α)蛋白表达 提取细胞总蛋白，检测蛋白浓度。十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)后将蛋白样品转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，封闭液室温封闭1 h，加入一抗(1∶1 000)4℃孵育过夜，加入二抗(1∶2 000)孵育2 h，曝光显影、定影、用Quantity One软件检测蛋白条带的灰度值，以目的条带和内参β-actin条带的比值作为蛋白表达水平。

1.6MTT检测细胞存活率 细胞培养48 h，加入20 μl MTT溶液，继续孵育4 h；加入 DMSO振荡反应10 min，酶标仪检测490 nm处吸光度(OD)值。细胞增殖存活率(%)=实验组OD值/空白对照组OD值×100%。

1.7流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组细胞后用预冷的PBS，结合缓冲液重悬细胞，依次加入Annexin V-FITC和PI，避光孵育15 min。流式细胞仪检测细胞凋亡。实验重复3次。

1.8荧光素酶报告基因实验检测PCAT19对miR-143-3p的靶向调控 构建含miR-143-3p结合位点的PCAT19野生型和突变型荧光素酶表达载体(WT-PCAT19和MUT-PCAT19)，将其分别与miR-con和miR-143-3p共转染至BCPAP细胞中。按说明书检测荧光素酶活性，实验重复3次。

1.9统计学分析 采用SPSS20.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1甲状腺癌细胞系中lncRNA PCAT19和miR-143-3p的表达 HT-ori3相比，BCPAP、TPC-1、SW1736中PCAT19 mRNA的表达水平显著升高，miR-143-3p的表达水平显著降低(P<0.05)。可见，在甲状腺癌细胞系中，lncRNA PCAT19高表达，miR-143-3p低表达。见表1。

表1 甲状腺癌细胞和正常甲状腺细胞系中lncRNA PCAT19和miR-143-3p的表达

与HT-ori3比较:1)P<0.05

2.2敲低PCAT19抑制甲状腺癌BCPAP增殖，诱导凋亡 与NC组及si-con组相比，si-PCAT19组PCAT19、CyclinD1表达水平显著降低，Cleaved-caspase-3表达水平显著升高(P<0.05)，BCPAP细胞存活率显著降低(P<0.05)，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。见图1、图2、表2。可见，敲低PCAT19抑制与BCPAP细胞增殖，促进细胞凋亡。

图1 CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白表达

NC组、si-con组、si-PCAT19组图2 流式细胞仪检测细胞凋亡

表2 敲低PCAT19抑制甲状腺癌BCPAP增殖，诱导凋亡

与si-PCAT19组比较：1)P<0.05

2.3高表达miR-143-3p抑制BCPAP增殖，诱导凋亡 与miR-con组相比，miR-143-3p组miR-143-3p、Cleaved-caspase-3表达水平显著升高，CyclinD1表达水平显著降低(P<0.05)，细胞存活率显著降低(P<0.05)，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。可见，高表达miR-143-3p抑制BCPAP细胞增殖，促进细胞凋亡。见图3、表3。

图3 NC组、miR-con组、miR-143-3P组CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白表达

表3 高表达miR-143-3p抑制BCPAP甲状腺癌细胞增殖，诱导凋亡

与miR-con组比较：1)P<0.05

2.4lncRNA PCAT19靶向miR-143-3p表达 通过starbase在线软件预测到PCAT19与miR-143-3p存在结合位点(图4)。转染野生型PCAT19表达载体后，相较于miR-con组，miR-143-3p组甲状腺癌细胞BCPAP的荧光素酶活性显著降低(P<0.05)；而转染突变型PCAT19表达载体后，甲状腺癌细胞BCPAP的荧光素酶活性差异不显著。见表4。相较于pcDNA组(0.35±0.05)，pcDNA-PCAT19组(0.10±0.02)，miR-143-3p的表达水平显著降低；相较于si-con组(0.32±0.03)，si-PCAT19组miR-143-3p的表达水平显著升高(3.88±0.39，P<0.05)。可见，PCAT19可靶向调控miR-143-3p的表达。

图4 通过starbase对PCAT19和miR-143-3p结合进行预测

表4 miR-con或miR-143-3p与报告质粒共转染BCPAP细胞后双荧光素酶活性检测

2.5miR-143-3p低表达可以部分逆转PCAT19低表达对BCPAP增殖和凋亡的影响 与si-PCAT19+anti-miR-con组相比，si-PCAT19+anti-miR-143-3p组miR-143-3p表达水平显著降低(P<0.05)，CyclinD1表达水平显著升高，Cleaved-caspase-3表达水平显著降低(P<0.05)，细胞存活率显著升高(P<0.05)，细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。见图5、表5。可见，miR-143-3p低表达可以部分逆转PCAT19低表达对BCPAP增殖抑制和凋亡促进的作用。

2.6PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达 与si-con组相比，si-PCAT19组p-AKT、PI3Kp110α表达水平显著降低；与si-PCAT19+anti-miR-con组相比，si-PCAT19+anti-miR-143-3p组p-AKT、PI3Kp110α表达水平显著升高(P<0.05)。可见，敲减PCAT19可以抑制PI3K/AKT信号通路p-AKT、PI3Kp110α的表达，而miR-143-3p低表达可以部分逆转PCAT19低表达对p-AKT、PI3Kp110α的表达的抑制作用。见表5、图6。

1～4:si-con组;si-PCAT19组;si-PCAT19+anti-miR-con组;si-PCAT19+anti-miR-143-3p组；图6同图5 各组CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白表达

表5 miR-143-3p低表达对细胞增殖、侵袭和迁移及相关蛋白表达的影响

与si-con组比较：1)P<0.05；与si-PCAT19+anti-miR-con组比较：2)P<0.05

图6 Western印迹检测p-AKT和PI3Kp110α的表达

3 讨 论

甲状腺癌近年来发病率逐渐升高，严重危害人类健康，研究可用于甲状腺癌诊断和预后预测的生物标志物及治疗靶点，对临床具有重要意义〔12〕。lncRNA 和miRNA均属于非编码RNA，参与甲状腺癌细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移等过程，可作为甲状腺癌诊断、预后的标志物及治疗靶点〔13,14〕。PCAT1、PCAT7与PCAT19同属PCAT家族，有研究报道PCAT-1过表达通过调节细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDKN)1A促进胃癌细胞的增殖和转移〔15〕；PCAT-1还促进前列腺癌细胞增殖和侵袭，并且与前列腺癌患者的不良预后相关〔16〕；PCAT19也促进前列腺癌进展〔4〕。过表达PCAT7通过抑制miR-134-5p可促进非小细胞肺癌细胞增殖，抑制细胞凋亡，促进细胞转移〔17〕。以上结果表明上调表达的PCAT均促进肿瘤的进展，本实验结果显示，PCAT19在甲状腺癌细胞中与上调表达，敲低PCAT19可抑制Cyclin D1蛋白的表达，促进Cleaved-caspase-3蛋白的表达；抑制甲状腺癌细胞BCPAP增殖，促进细胞凋亡。且PCAT19靶向负调控miR-143-3p。

有研究报道沉默lncRNA肺癌转移相关转录本(MALAT)1可通过miR-143-3p调节锌指E-box结合同源异型盒转录因子(ZEB)1表达进而抑制肝癌细胞增殖和侵袭〔18〕。在宫颈癌组织和细胞系中miR-143-3p低表达，敲低lncRNA HOX反义基因组RNA(HOTAIR)通过上调miR-143-3p能抑制宫颈癌细胞的增殖、促进细胞凋亡〔19〕。miR-143-3p在创伤后增生性瘢痕组织和成纤维细胞中也显著下调表达，miR-143-3p通过AKT/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途径靶向结缔组织生长因子(CTGF/CCN2)可抑制增生性瘢痕形成〔20〕。以上结果表明，miR-143-3p可被lncRNA调控进而影响肿瘤的进展，且其也可以靶向调控下游信号通路或靶基因而影响肿瘤的发生发展。本实验研究结果显示，miR-143-3p在甲状腺癌细胞中也呈低表达，过表达miR-143-3p抑制CyclinD1蛋白的表达，促进Cleaved-caspase-3蛋白的表达；抑制甲状腺癌细胞BCPAP增殖，促进细胞凋亡。且miR-143-3p受lncRNA PCAT19的靶向调控，miR-143-3p低表达可部分逆转PCAT19低表达对BCPAP细胞增殖抑制和凋亡促进的作用；还逆转了PCAT19低表达对p-AKT和PI3Kp110α的抑制作用。

AKT和PI3Kp110α是PI3K/AKT信号通路中的作用分子，PI3K/AKT信号转导通路的活化可使甲状腺细胞异常增殖，促进甲状腺结节的发生、发展〔21〕。研究发现PI3K抑制剂通过抑制p-AKT的表达可抑制甲状腺未分化癌HTH-15细胞增殖，促进细胞凋亡，降低细胞侵袭能力〔22〕。下调PI3K/AKT信号通路可抑制甲状腺癌细胞的侵袭〔23〕；通过抑制甲状腺癌细胞中PI3K/AKT途径可增强TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导的细胞凋亡〔24〕。以上结果均表明PI3K/AKT信号通路在甲状腺癌中起致癌作用，抑制该通路的激活可抑制甲状腺癌的进展。本实验中敲低PCAT19抑制甲状腺癌细胞BCPAP增殖，促进细胞凋亡。且敲低PCAT19抑制p-AKT和PI3Kp110α的表达，即抑制PI3K/AKT信号通路的激活；此外，miR-143-3p低表达可逆转PCAT19低表达对p-AKT和PI3Kp110α的抑制作用。提示PCAT19可能通过miR-143-3p进而调控PI3K/AKT信号通路，从而影响甲状腺癌细胞增殖和凋亡。

综上所述，lncRNA PCAT19可抑制甲状腺癌细胞增殖，促进其凋亡，其机制可能与miR-143-3p及PI3K/AKT信号通路有关，将可为甲状腺癌的预防、治疗和预后提供新的生物标志物和新靶点。