RNA结合蛋白对大鼠胰岛β细胞株RINm凋亡的保护作用

刘冬燕 兰倩妮 丁晓明 张少俭

糖尿病(DM)是常见慢性非传染性疾病，发病率呈不断上升趋势，严重威胁人类健康[1]。胰岛β细胞损伤及功能减退可使机体胰岛素分泌不足，葡萄糖代谢异常，从而导致DM的发生。细胞凋亡是引起胰岛β细胞总量减少和功能减退的主要原因[2]。组织学研究显示，DM患者胰岛组织中巨噬细胞数量较正常机体增多，可能上调胰岛组织中炎症因子表达，损伤胰岛β细胞，促进胰岛β细胞凋亡[3,4]。

RNA结合蛋白Tristetraprolin(TTP)由锌指蛋白36(ZFP36)编码，属于CCCH型锌指蛋白家族原型成员，可与多种靶mRNA的保守AU重复序列(ARE)结合而使后者降解[5]。有研究表明，TTP在炎症信号传导和肿瘤细胞增殖、凋亡中起重要作用，参与风湿性关节炎、乳腺癌等多种疾病的发生和发展[6，7]。本文通过细胞转染技术制备TTP过表达和TTP表达抑制大鼠肺泡巨噬细胞NR8383，观察其培养上清液对胰岛β细胞株RINm凋亡的影响，为DM治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验细胞、试剂和仪器

大鼠肺泡NR8383巨噬细胞(批号：CRL-2192)、大鼠胰岛β细胞株RINm(批号：CRL-2057)、低糖DMEM培养基(批号：30-2001)、胎牛血清(批号：30-2020)购自美国典型菌种保藏中心；F-12K培养基(批号：UFJC0702)购自上海君瑞生物技术有限公司；兔抗人TTP多克隆抗体(批号：LS-B1572)、兔抗人白细胞介素-6(IL-6)多克隆抗体(批号：NB600-1532)购自上海煊翎生物科技有限公司；兔抗人β-actin多克隆抗体(批号：XFC1655)购自上海信帆生物科技有限公司；LipofectamineTM2000转染试剂(批号：11668027)购自美国Invitrogen公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(批号：40302ES20)购自上海前尘生物科技有限公司；Trizol试剂(批号：15596)、PVDF膜(批号：BSP0161)、ECL发光液(批号：PE0030)、RIPA裂解液(批号：R0020)购自北京Solarbio公司；TaKaRa反转录试剂盒(批号：RR047A)、TaKaRa实时荧光定量PCR试剂盒(批号：RR820A)购自宝生物工程(大连)有限公司；pcDNA 3.1载体(批号：60548)购自中国爱迪基因公司；引物序列由北京六合华大基因科技有限公司合成；MCO-18AC型CO2培养箱购自日本SANYO公司； FACSCanto II流式细胞仪购自美国BD公司；NanoDrop微量核酸测定仪购自上海创萌生物科技有限公司。

1.2 NR8383巨噬细胞培养、分组及TTP、IL-6基因和蛋白测定

1.2.1NR8383巨噬细胞培养和分组：复苏NR8383大鼠肺泡巨噬细胞，加入含15%胎牛血清的F-12K培养基，置于37℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，2-3天换液一次。取对数生长期NR8383巨噬细胞，以3×105个/孔接种6孔板，待细胞融合度约50 % 时，按照LipofectamineTM2000转染试剂说明书，分别将pcDNA 3.1空载体(pcDNA 3.1组)、TTP过表达载体(pcDNA 3.1-TTP组)、siRNA阴性对照序列(si-NC组)、TTP siRNA序列(siRNA-TTP组)转染至NR8383细胞，同时设置仅添加LipofectamineTM2000转染试剂的空白对照组(NC组)。每组设置3个复孔。转染12h后，更换新鲜培养基。继续培养至36h，收集培养细胞和上清液用于下述实验。

1.2.2各组NR8383巨噬细胞中TTP和培养上清液中IL-6基因测定：Trizol试剂提取各组细胞及上清液中总RNA。NanoDrop微量核酸测定仪检测RNA纯度和浓度。参照TaKaRa反转录试剂盒，将提取的RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环。引物及序列见表1。每个样品重复3次。以β-actin为内参，采用2-△△Ct法计算TTP和IL-6基因的相对表达水平。

表1 RT-qPCR引物及序列

1.2.3各组NR8383巨噬细胞中TTP和上清液中IL-6蛋白测定：加入含蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液裂解上述各组细胞，于冰上充分裂解30min，4℃、12 000g离心15min，取上清；再于4℃、12 000g离心15min，取上清。BCA蛋白试剂盒检测蛋白浓度。取适量蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后将蛋白样品电转至PVDF膜上，5% 脱脂奶粉封闭液室温封闭1h。分别加入兔抗人TTP多克隆抗体(1∶1 000)、兔抗人IL-6多克隆抗体(1∶1 000)、兔抗人β-actin多克隆抗体(1∶1 000)，4℃ 孵育过夜。TBST洗膜后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶5 000)，室温孵育2h。TBST洗膜3次后，加入ECL显影液室温避光显影，Bio-Rad凝胶成像系统曝光拍照，Image J软件分析蛋白条带灰度值。以β-actin为内参，TTP和IL-6蛋白的相对表达水平以其与β-actin蛋白条带灰度比值表示。

1.3 胰岛β细胞株RINm凋亡检测

1.3.1胰岛β细胞株RINm培养和分组处理：复苏RINm细胞，加入含10% 胎牛血清的低糖DMEM培养基，置于37℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。2—3天换液一次。取对数生长期RINm细胞，以3×105个/孔接种至6孔板。细胞贴壁后，分别将1.2中收集的各组NR8383巨噬细胞上清液加入培养的RINm细胞中，分别形成与前述对应的pcDNA 3.1 + RINm组、pcDNA 3.1-TTP+RINm组、si-NC+RINm组、TTP si-TTP+RINm>组、NC+RINm组，每组3个复孔。继续培养24h后，吸弃上清液，0.25%胰蛋白酶消化，收集RINm细胞进行凋亡检测。

1.3.2RINm细胞凋亡检测：各组RINm细胞用预冷的PBS清洗2次。参照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书，用1×结合缓冲液调整细胞浓度为1.0×106个/ml。取100μl RINm细胞悬液，加入5μl的Annexin V-FITC和5μl碘化丙锭(PI)，室温避光孵育10min；再加入400μl 1×结合缓冲液，混合均匀后，上流式细胞仪检测。细胞凋亡率=(早期凋亡细胞+晚期凋亡细胞)/细胞总数×100%。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 各组NR8383巨噬细胞TTP和IL-6基因和蛋白水平比较

各组间TTP mRNA和蛋白表达水平、IL-6 mRNA和蛋白表达水平差异均有统计学意义(P< 0.01)。pcDNA 3.1组、si-NC组和NC组间TTP 、IL-6 mRNA和蛋白表达水平比较差异均无统计学意义(F=3.32，F=2.88；F=1.20，F=2.90，P均>0.05)。两两比较，pcDNA 3.1-TTP组NR8383巨噬细胞中TTP mRNA和蛋白水平较pcDNA 3.1组明显上调(t=10.09、10.36，P均<0.01)；si-TTP组则明显下调(t=15.44、23.30，P均<0.01)。pcDNA 3.1-TTP组NR8383巨噬细胞培养上清液中IL-6 mRNA和蛋白水平较pcDNA 3.1组明显下调(t=15.20、10.44，P均<0.01；)；si-TTP组则明显上调(t=33.28、23.15，P均<0.01)。见图1、表2。

图1 各组NR8383细胞的TTP和IL-6蛋白电泳图

表2 各组NR8383巨噬细胞TTP和IL-6基因和蛋白水平比较均=3)

注：与pcDNA 3.1组比较，1)P<0.01

图2 各组胰岛β细胞株RINm凋亡流式图

2.2 各组胰岛β细胞株RINm凋亡率比较

各组间RINm凋亡率差异均有统计学意义(P<0.01)。pcDNA 3.1+RINm组、si-NC+RINm组和NC+RINm组间胰岛RINm细胞凋亡率比较，差异无统计学意义(F=0.23，P>0.05)。两两比较， pcDNA 3.1-TTP+RINm组RINm细胞凋亡率较pcDNA 3.1+RINm组明显下调(t=19.94，P<0.01)，si-TTP+RINm组则明显上调(t=22.38，P<0.01)。见图2、表3。

表3 各组RINm细胞凋亡率比较均=3)

注：与 pcDNA 3.1+RINm组比较，1)P<0.01

3 讨 论

TTP基因由2个外显子和1个内含子组成，定位于19q 13.1染色体区域，主要存在于细胞核中，在炎症、癌症等疾病的发展中起重要作用[8]。研究表明，TTP通过与肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素-1β(IL-1β) 3’-UTR上的ARE结合促进TNF和IL-1β mRNA降解，从而抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导途径，调控细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程[9,10]。本研究结果显示，TTP过表达可明显减少NR8383巨噬细胞IL-6 mRNA和蛋白的分泌，而抑制TTP表达则明显促进NR8383巨噬细胞分泌IL-6 mRNA和蛋白，与有关文献报道结果[11]相一致，提示TTP参与调节炎性因子的作用。

胰岛β细胞可根据机体葡萄糖浓度分泌胰岛素，维持葡萄糖平衡。DM患者可能出现胰岛β细胞凋亡所致葡萄糖失衡以及炎症反应[12]。已有研究表明，抑制或下调巨噬细胞TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子表达，能够保护胰岛β细胞，减少胰岛淀粉样多肽造成的β细胞损伤[13]和炎性因子引发的胰岛β细胞凋亡[14]。本研究采取TTP转染巨噬细胞，分别取其过表达组和表达抑制组NR8383培养上清作用于胰岛β细胞RINm，结果显示，过表达TTP上清液可促进RINm细胞凋亡，而TTP表达抑制的上清液则能显著抑制RINm细胞凋亡，其机制可能与过表达TTP可以改善胰岛素炎症反应有关[15]。

综上所述，过表达TTP可抑制巨噬细胞分泌炎性细胞因子IL-6，降低胰岛β细胞株RINm凋亡率，该结果为DM的临床治疗新靶点提供了初步实验依据。

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