不同连作年限硒砂瓜土壤细菌群落结构特征

岳思君，冯翠娥，杨彦研，陈丽萍，郭 洋，郑 蕊，苏建宇

(宁夏大学生命科学学院，西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室, 宁夏 银川 750021)

连作障碍作为长期困扰农业生产可持续发展的原因之一，其形成机制一直是农业发展研究的热点。影响农作物连作障碍发生的因素有很多，有研究表明，其主要原因是由于土壤生态环境失衡[1]。土壤微生物在土壤生态环境中生物与环境物质循环和能量转换间扮演重要角色，是土壤环境正常运行的重要组成部分[2]。同时，土壤微生物对土壤基质变化比较敏感，对土壤养分的吸收与转化、作物生长发育有显著影响[3]。连作土壤中土壤微生物群落结构与功能的改变是导致土壤肥力下降、作物减产的主要原因[4]。连作会破坏土壤微生物群落结构与物种多样性，促进病原微生物的生长与积累，抑制有益微生物繁殖，作物产量显著降低[5-6]。同时，土壤微生物多样性和群落结构也会受到作物连作时间的影响，连作时间越长，微生物群落结构差异越明显[7-8]。细菌是土壤环境中重要的微生物类群，研究表明，连作会影响土壤细菌的群落结构，阻碍马铃薯、棉花、番茄等作物的生长[9-11]。

硒砂瓜主产于宁夏中卫市环香山地区，其采用压砂栽培技术，并富含硒元素，故得名“硒砂瓜”，是当地主要的经济作物。硒砂瓜栽培生产中由于西瓜枯萎病而导致连作障碍严重，硒砂瓜产量和品质受到明显影响。目前，对于硒砂瓜土壤中细菌多样性以及连作时间对土壤细菌群落结构的影响少有报道，研究阐明连作条件下硒砂瓜土壤细菌群落结构及变化规律，对减少硒砂瓜土传病害发生，提高硒砂瓜产量和品质具有重要意义。本研究应用高通量测序技术，分析宁夏中卫市环香山地区不同连作年限硒砂瓜土壤细菌群落结构特征，为采用合理有效方法防治连作条件下硒砂瓜土传病害的发生提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究地概况

试验地点位于宁夏中卫市沙坡头区(105°25′ E、36°97′ N)，海拔1 642.0 m，年平均气温8.8℃，年降水量179.6 mm，年蒸发量为1 829.6 mm，供试土为砂土。

试验设置5个处理：分别为连作5 a(T5)、10 a(T10)、15 a(T15)、20 a(T20)及对照土壤(T0，未种植硒砂瓜)，各处理分别设置3个重复，根据连作时间进行试验设计。

1.2 样本采集

于2017年10月1日在试验区采样。硒砂瓜采收后期去除表层(0～15 cm)砂石，在深度为15～25 cm处取土，每个处理各采集3份土壤，每份土样分别采用五点取样法取样，除去土壤中的植物根系、碎石及其他杂物，混匀成1份土样装进塑封袋，置入冰盒带回实验室，一部分鲜土置于超低温冰箱，用于微生物多样性研究；另一部分土样自然风干后过1 mm筛子，用于测定土壤中全氮、全钾、全磷、碱解氮、速效磷、速效钾、pH值、有机质等。

1.3 土壤理化性质测定

按照土壤农化分析方法[12]，土壤pH值采用电位法测定(水∶土=2.5∶1)；土壤有机质含量测定采用重铬酸钾外加热法，全氮采用凯氏定氮法，碱解氮采用扩散法，全磷采用矾钼黄比色法，速效磷采用钼锑抗比色法，全钾采用ICP法，速效钾采用原子吸收分光光度计法。

1.4 Illumina Miseq测序

土壤样本送上海美吉生物医药科技有限公司的Illumina Miseq PE300 平台(San Diego, CA, USA)进行16s rDNA高通量测序。

1.5 序列分析

原始测序序列使用Trimmomatic[13]软件质控，使用FLASH软件进行拼接：去除质控后长度低于50 bp的序列；去除模糊碱基；根据重叠碱基overlap将两端序列进行拼接。使用的UPARSE v7.1软件[14]，对有效数据在97%的相似度水平进行操作分类单元OTU聚类；使用UCHIME软件[15]剔除嵌合体。利用RDP classifier (http://rdp.cme.msu.edu/)[16]对每条序列进行物种分类注释，比对Unite(Release 6.0 http://unite.ut.ee/index.php)数据库，设置比对阈值为70%，并在各个水平上统计样本的群落组成。

1.6 数据分析

试验数据采用Microsoft Excel 2016进行计算，通过SPSS 19.0进行单因素方差分析(P<0.05)，表中数据均采用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 硒砂瓜连作对土壤理化性质的影响

不同连作年限土壤pH值均大于8，为碱性土。土壤pH值随连作年限的增加而增大，至连作20 a略有降低；与T0土壤相比，T5～T20土壤有机质、全氮、速效钾、全磷含量均增加，其中T5土壤中全氮、速效磷、全磷、速效钾、碱解氮含量最高，T15土壤中有机质含量最高。从结果可知，土壤综合理化性质与硒砂瓜连作年限不存在相关性。因此，硒砂瓜连作障碍不是由于土壤理化性质的改变所导致的(表1)。

2.2 测序数据分析

对5份不同连作年限的硒砂瓜土壤样本v3-v4区进行Illumina 高通量测序并进行优化后，5份土壤样本共获得835 534条序列，平均序列长度为438.99，总碱基数为366 797 133 bp。基于Sobs指数的稀释曲线分析(图1)表明，各样本的稀释曲线基本趋向平坦，说明本次测序数据量合理，能够比较真实地反映土壤样本的细菌群落。

2.3 硒砂瓜连作土壤中细菌的多样性

对不同连作年限硒砂瓜土壤中细菌进行Alpha多样性分析，结果见表2。结果表明，T0土壤细菌多样性最低，随着连作年限的增加，硒砂瓜土壤中细菌多样性逐渐增加，T20土壤细菌多样性最高。硒沙瓜土壤中细菌多样性随着连作年限的增加而增加。

表1 不同连作年限的土壤理化性质

注：T0、T5、T10、T15、T20分别指未种植硒砂瓜处理及连作5、10、15、20 a处理，下同。

Note: T0, T5, T10, T15, and T20 refer to the treatment of non-planted selenium-sand melon and continuous cropping for 5, 10, 15 a and 20 a, respectively. The same below.

2.4 硒砂瓜连作土壤细菌群落组成与结构分析

根据高通量测序结果分析，从5份供试土壤样本中共检测出细菌39门、98纲、189目、349科、620属、1195种。在门水平上(图2)，不同连作年限的硒砂瓜土壤物种组成较为相似，其中放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)相对丰度超过10%，丰度分别为20.71%～24.14%、17.08%～24.14%、15.82%～18.45%、11.76%～18.83%，是硒砂瓜土壤中的优势细菌群落；此外厚壁菌门(Firmicutes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、浮霉菌门(Planctomycetes)、unclassified-norank在土壤中相对丰度大于1%，是土壤中细菌主要的门。与T0相比，随连作时间增加，变形菌门、绿弯菌门丰度呈逐渐下降趋势，酸杆菌门丰度呈逐渐增加的趋势，且在T15中丰度最高，为18.83%，且T0中变形菌门、T5中放线菌门、T15中酸杆菌门细菌丰度最高，分别为24.14%、25.97%、18.83%；T0、T10中变形菌门、硝化螺旋菌门细菌丰度显著高于其它组份物种丰度(P<0.05)。

在纲水平上(图3)，土壤样本中优势纲分别为放线菌纲(Actinobacteria)、酸杆菌纲(Acidobacteria)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、芽单胞菌纲(Gmmatimonadetes)、杆菌纲(Bacilli)、热原体纲(Thermomi-crobia)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria)。在T5中放线菌纲丰度最高为25.97%，酸杆菌纲随连作年限增加呈先增加后下降趋势，并在T15中丰度达到18.83%，γ-变形菌纲在T5中丰度最低(5.23%)，在T20中杆菌丰度最高(8.18%)。

注：不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)。Note: Different letters indicate significant difference at P<0.05.图1 硒砂瓜连作土壤样本在OTU水平稀释曲线Fig.1 Rarefaction curves of OTU level in soil samples of selenium-sand melon continuous cropping

表2 不同连作年限硒砂瓜土壤细菌多样性指数和丰富度指数

在目水平(图4)，丰度前5的类群分别为norank_c_Acidobacteria、芽孢杆菌目(Bacillales)、芽单胞菌目(Gemmatimonadales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、酸微菌目(Acidimicrobiales)。随连作年限增加，norank_c_Actinobacteria丰度先增加后减少，在T15中丰度为13.97%；芽孢杆菌目在T15中丰度最低(5.08%)，在T20中丰度最高(8.15%)；芽单胞菌目在T10中丰度最高(7.77%)；根瘤菌目在T5中丰度最高(6.64%)；随连作年限增加，酸微菌目丰度呈下降趋势。

图2 硒砂瓜不同连作年限土壤细菌群落在门水平相对丰度Fig.2 Relative abundance of soil bacterial communities at phylum level in different continuous cropping years of selenium-sand melon

图4 硒砂瓜不同连作年限土壤细菌群落在目水平相对丰度Fig.4 Relative abundance of soil bacterial communities at order level in different continuous cropping years of selenium-sand melon

图5 硒砂瓜不同连作年限土壤细菌群落在科水平相对丰度Fig.5 Relative abundance of soil bacterial communities at family level in different continuous cropping years of selenium-sand melon

在科水平(图5)，丰度前6的类群分别为norank_c_Acidonbacteria、芽单胞菌科(Gemmatimonadaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、norank_c_Actinobacteria、norank_o_JG-KF-CM45、厌氧绳菌科(Anaerolineaceae)。随连作年限增加，norank_c_Actinobacteria丰度先增加后减少，在T15中丰度为13.97%；芽单胞菌科在T5中丰度最低(4.21%)，在T10中丰度最高(7.77%)；芽孢杆菌科在T10中丰度最高为5.84%，其次是T20(5.80%)，厌氧绳菌科在T0中丰度最高(3.99%)，在T5中丰度最低(1.50%)。

2.5 硒砂瓜连作土壤样本比较分析

基于细菌OUT水平主成分分析结果表明， T10、T15、T20土壤样本点距离比较近，T5与T15、T20样本部分距离较近，群落结构相似，而T0土壤样本单独聚在一起，群落结构与其他连作土壤样本中的群落结构不同，表明长期种植硒砂瓜后，土壤细菌群落结构会趋于一致性(图6)。

图6 硒砂瓜不同连作年限土壤细菌基于OTU水平的PCA分析Fig.6 PCA analysis of soil bacterial based on OTU level in different continuous cropping years of selenium-sand melon

2.6 土壤理化性质与细菌群落的相关性

对土壤细菌群落与土壤理化因子进行冗余分析(RDA)，结果如图7所示。有机质、速效磷是硒砂瓜连作土壤细菌群落组成的主要影响因子。

对不同连作年限硒砂瓜土壤细菌群落组成(纲水平)与土壤理化因子间相互关系分析发现，放线菌纲与土壤理化性质无显著相关性(P>0.05)，酸杆菌纲与有机质含量呈极显著正相关(P<0.01)，α-变形菌纲与速效磷含量呈极显著正相关(P<0.01)，芽单胞菌纲与全磷含量呈显著负相关(P<0.01)，杆菌与有机质含量呈极显著负相关(P<0.01)，热原体纲与全磷、碱解氮含量呈显著正相关(P<0.05)，与全钾含量呈显著负相关(P<0.05)(表3)。

图7 土壤细菌群落与土壤理化因子的RDA分析Fig.7 RDA analysis of soil bacterial communities and soil physicochemical properties

表3 土壤细菌群落结构与土壤理化性质的相关性

注：**P<0.01; *P< 0.05.

3 讨 论

硒砂瓜是宁夏地区特有的经济作物，但连作障碍对硒沙瓜产量和品质造成严重影响，是目前亟待解决的问题[17]。连作障碍发生的原因主要有土壤营养失衡、土壤理化性质恶化、土壤微生物群落结构失衡等。Xu等[18]研究黄连连作发现，随着连作时间的增加，碱解氮、速效磷和速效钾含量都出现增加的趋势，与本研究中T5～T20土壤有机质、全氮、速效钾、全磷含量均增加的结果相似，硒砂瓜连作障碍并不是由于土壤理化性质的改变所导致。

土壤微生物对作物的健康生长起着重要作用，有益微生物能增加土壤肥力、改善根际土壤环境、促进根系的生长和防治植物病害等[19]。越来越多的研究表明，连作障碍与作物根际土壤微生物密切相关[20]。龚治翔等[21]研究表明，造成连作障碍的主要原因是由于土壤微生物群落结构的改变；朱菲莹等[22]研究结果显示，根际土壤细菌群落结构是影响西瓜枯萎病发生的主要环境因子。

本研究结果表明，不同连作年限硒砂瓜土壤细菌优势群落主要为放线菌门、变形菌门、绿弯菌门、酸杆菌门、厚壁菌门，这与香榧、棉花、苎麻等的相关研究结果[23-25]相似。其中放线菌门随着连作时间的增加，会出现先增加后下降的趋势，在T5中丰度最高(图2)，放线菌门大多数微生物主要降解纤维素甚至许多难降解的芳香族化合物，对于土壤的矿化作用起十分重要的作用[26]。70%抗生素来源于放线菌，其产生的抗生素及其代谢产物对动物植物等都具有重要作用[27]。可推测放线菌门在作物的连作过程中会抑制病原菌的侵害，其对长期连作土壤土传病害有一定的防治能力。变形菌门和放线菌门都是土壤中有益的菌门，参与各种有机物碳氮循环，如固氮菌，对作物在土壤中氮的吸收有一定的作用。绿弯菌门是一种能通过光合作用并以CO2为碳源产生能量的微生物，在有机质等营养含量低的土壤中也有较强的竞争力，而硒砂瓜种植于干旱的沙漠地区，压砂种植，日照充足，土壤贫瘠，因此，绿弯菌门可能对硒砂瓜的生长具有重要作用。酸杆菌门是土壤微生物的重要成员，能降解植物残体、进行光合作用、参与碳化合物代谢等，在土壤物质循环和生态环境构建过程中起到非常重要的作用[28]。聂园军等[29]研究表明，随着连作时间的增加，西瓜土壤中有益微生物的降低而病原菌所在的镰刀菌属(Fusarium)相对丰度增加，造成西瓜枯萎病的发生。本研究中，随着连作时间的增加，放线菌门、变形菌门、绿弯菌门丰度逐渐下降，可推测其有益菌丰度的降低，使得土壤抵抗性差，土壤中病原菌数量增加，从而造成连作障碍。

在目水平上，芽孢杆菌目、芽单胞菌目、根瘤菌目是硒砂瓜土壤中的优势类群。研究表明，绝大多数芽孢杆菌都是有益菌，对植物病原菌的防治具有重要价值[30]，李丹等[31]研究表明，解淀粉芽胞杆菌对西瓜枯萎病有较强的防治作用，岳菊[32]筛选的枯草芽孢杆菌对西瓜枯萎病的防效达 80.4%。本试验结果表明，随着连作时间的增加，芽孢杆菌目丰度呈现先增后降再升的趋势，在T15土壤中丰度最低，在T20土壤中丰度最高，可能是由于随着连作时间的增加，病原菌数量增加，导致芽孢杆菌目中有益菌数量减少；芽孢杆菌目在T20土壤中丰度增加，可能是由于长时间的连作使得土壤中细菌菌群变化较大，因为长期连作扰乱了细菌群落结构，导致细菌群落增多[21,33]，同时，这也与本研究中不同连作年限土壤细菌多样性增加的结果一致。

4 结 论

不同连作年限硒砂瓜土壤理化性质变化不显著，硒沙瓜连作障碍的产生不是由于土壤理化性质的变化引起的，而是由于土壤微生物群落结构的变化所导致的。随着连作时间的增加，细菌群落结构发生改变，细菌群落增多，连作土壤中细菌群落多样性增加。在群落结构上，放线菌门、变形菌门、绿弯菌门、酸杆菌门、厚壁菌门等有益微生物丰度的下降，造成连作障碍的产生。研究结果对于采用合理有效的方法改善土壤连作障碍具有重要意义。