农业氮污染治理技术中脱氮菌的研究进展

2020-04-29潘永亮蔡名旋

广东农业科学 2020年2期

潘永亮，黑亮，黄徐，刘雯，蔡名旋

（1.水利部珠江河口动力学及伴生过程调控重点实验室/珠江水利委员会珠江水利科学研究院，广东广州 510611；2.仲恺农业工程学院环境科学与工程学院，广东广州 510225）

氮素是植物生长不可缺少的元素［1］，因此氮肥被大量投入农业生产之中。投放大量氮肥可以保证农作物产出，但是相当一部分氮肥会随着土壤流失［2］及地表水渗透［3］，造成水环境中氮污染问题。氮在水中的含量较高时，水就变成氮污染废水［4］，它不仅破坏土壤的种植能力［5］，还会导致水体富营养化［6］，使水变得腥臭浑浊，造成鱼类大面积死亡［7］，对农业生产力造成巨大影响［8］，氮元素会在人体内通过亚硝化作用转换成亚硝酸盐［9］，长期饮用氮污染水会诱发高铁血红蛋白症状和癌症［10］，对人们健康产生严重威胁。杨志辉等［11］、郑翔［12］通过数学模型计算，发现农业造成的氮污染问题已经对我国的生产效率、就业、经济衰退等问题产生了严重影响。由此可见，大量使用氮肥之后造成的氮污染废水对我们的生活产生了严重威胁，治理刻不容缓。蔡彦明等［13］、陈鸿展等［1］一致认为农业氮污染治理分为源头控制、过程削弱、污染治理3个部分。首先是投放氮肥时必须合理科学，减少氮肥浪费；其次是在污染途径中建立缓冲带，削弱氮污染浓度，最后是治理污染水体，达到治理效果［14］。但前两部分可以通过人们的行为进行控制，而重污染水体却无法自身治理，因此本文从治理氮污染废水方面进行探究，寻求农业氮肥污染废水的治理方法，减少农业工程化对我国环境造成的影响。

目前，氮污染废水处理技术主要有吹氮法、离子交换法、折点氯化法、生物脱氮法、化学沉淀法等［4］，其中生物脱氮法因其操作容易、效果相对稳定、不产生二次污染等优势，吸引着学者们的研究［15］。脱氮菌是生物脱氮技术的根本，推进脱氮菌的发展进程，对治理水体氮污染具有重要意义。自从生物脱氮技术兴起后，许多学者便致力于从不同环境中筛选出高效脱氮菌，并探究其性能，这对生物脱氮技术治理农业问题有着重要意义。本文主要从脱氮菌的脱氮机理、分离鉴定、影响因素及实际应用等方面进行综述，总结各种高效脱氮菌生存环境的相似之处，为未来高效脱氮菌的研究提供参考，并对脱氮菌的发展进行论述，对生物脱氮技术治理农业问题进行展望。

1 脱氮菌的定义及脱氮机制

1.1 脱氮菌定义

脱氮菌是指在生物脱氮过程中参与脱氮反应的菌株。脱氮过程一般可分为氨化过程、硝化过程和反硝化过程［16］，参与氨化过程的菌称为氨化细菌，参与硝化过程的菌称为硝化细菌，参与反硝化过程的菌称为反硝化细菌。但氨化过程在一般水体中均能完成［17］，因此本文对氨化细菌不予论述。

1.2 脱氮机理

脱氮菌的脱氮机理如图1所示，废水中存在以有机氮、氨氮、亚硝态氮、硝态氮等形式的氮，在反应过程中，氨化细菌会将有机物转化成NH4+；然后在有氧条件下，硝化细菌会将NH4+转换成 NO2-，再转化成 NO3-；而在缺氧条件下，反硝化细菌会将NO2-和NO3-还原成无毒害的N2［19］。

图 1 脱氮菌的脱氮机理Fig.1 Nitrogen removal mechanism of denitrifying bacteria

2 脱氮菌的分离、鉴定和脱氮效率研究

脱氮菌对环境适应能力强，生长发育时间短，对现实氮污染的治理有着重要作用。邵媛媛［19］用筛选出来的脱氮菌XP1来加强人工湿地的治理，效果十分显著，强化后的人工湿地对COD的最大去除率达到73%，对氨氮的去除率达到94%，对总氮的去除率达到78%，高氨氮污水经过治理后达到一级标准，治理时间比强化前缩短至少15 d。山东某养殖场池水氨氮严重超标，池中的虾出现了各种疾病，造成虾大量死亡，武和英［20］对此进行生物脱氮研究，投放多种菌株进入受污池水中48 h后，池水氨氮已经达到养殖标准，其中菌株DZYC02效果显著，氨氮去除效率高达96%，池水受污染的问题得到了解决；黄国鑫等［21］利用脱氮菌修复地下水，可见脱氮菌有十分可观的研究前景。脱氮菌包括硝化细菌和反硝化细菌，下面分别对硝化细菌和反硝化细菌的分离鉴定和脱氮效率进行讨论。

2.1 硝化细菌的分离鉴定和脱氮效率研究

2.1.1 硝化细菌的分离鉴定细菌的鉴定分为形态学鉴定、生理生化鉴定和基因测定［22］。形态学鉴定就是观察菌株的状态和形态，掌握高效硝化细菌的形态规律，以识别菌株是否为硝化细菌，然后通过《伯杰细菌分类手册》进行生理生化鉴定［23］，最后通过基因测序鉴定菌株的种类。革兰氏染色法［24］是鉴定菌株中一种简单方便的方法，不仅能用来观察菌株形态，还能鉴别菌株。为了研究高效脱氮菌的规律，本文对这些高效硝化细菌的鉴定方法进行对比，由高效硝化细菌的形态学观察与革兰氏染色法的结果（表1）可知，高效硝化细菌的菌落状态多为带颜色的圆形不透明菌株，属杆状菌，革兰氏染色结果呈阴性。

表1 高效硝化细菌形态学特征与革兰氏染色结果Table 1 Morphological characteristics and Gram staining results of efficient nitrifying bacteria

2.1.2 硝化细菌的脱氮效率研究随着生物脱氮技术的日益发展，许多学者致力于筛选出更多脱氮效果好的硝化细菌，近年来在不同环境下筛选出的硝化细菌及其脱氮效率见表2。其中，有的菌株对某个氮污染指标的去除效率特别高，有些甚至达到100%，可见其对氮污染治理有着非常好的效果。

表2 高效硝化细菌的脱氮效率Table 2 Nitrogen removal efficiency of efficient nitrifying bacteria

2.2 反硝化细菌的分离鉴定和脱氮效率研究

2.2.1 反硝化细菌的分离鉴定由高效反硝化细菌形态学特征及革兰氏染色法的结果（表3）可知，高效反硝化菌和硝化菌的研究结果差距不大，菌株状态多为带颜色的圆形，属杆状菌，革兰氏染色结果基本呈阴性。由此可以看出，大多数脱氮菌为杆状菌，菌落状态为有颜色的圆形菌落，革兰氏染色法呈阴性。

表3 高效反硝化细菌形态学特征与革兰氏染色结果Table 3 Morphological characteristics and Gram staining results of efficient denitrifying bacteria

2.2.2 反硝化细菌的脱氮效率许多学者从不同环境中筛选出高效反硝化细菌，其脱氮效率如表4所示。由表4可知，大多数高效反硝化菌株的脱氮效率都高于90%，有些菌株的脱氮效率甚至达到100%，也有一部分高效反硝化菌株对于氨氮及硝态氮的去除率很高，但对于总氮的去除率一般。

表4 高效反硝化细菌的脱氮效率Table 4 Nitrogen removal efficiency of efficient denitrifying bacteria

3 影响脱氮菌生长的因素

每种菌株都有其最适宜的生存环境，在最佳培养条件下，菌株的性能、活性、繁殖能力大大提升［45］，探究影响菌株生长的因素，是找到最佳培养条件的关键。研究影响脱氮菌生长的因素对废水中氮污染的治理非常重要。影响脱氮菌生长的因素有碳源、温度、溶解氧、pH、碳氮比、转速、微量元素和有毒物质等［45］。

3.1 硝化细菌影响因素

3.1.1 碳源种类任何生物的发育都离不开营养物质和能量，脱氮菌也不例外。碳源是脱氮菌的营养物质和能量来源。王莹［33］筛选出的高效脱氮菌WY-01，分别用乙醇钠、乙酸钠、丙酸钠、丙酮酸钠、丁酸、丁二酸钠、苹果酸钠、延胡素钠和柠檬酸钠作为碳源进行研究，结果发现以丙酮酸钠和柠檬酸钠为碳源时，脱氮效果最高，达到97%；陈小岚［28］筛选出的JB4，在以乳糖、蔗糖、丙酸钠、酒石酸钾钠、葡萄糖、乙醇、乙酸钠、丙酮酸钠、柠檬酸钠、琥珀酸钠为碳源的研究中发现，丁二酸钠为碳源时的效果最好，氨氮去除率达到86.08%；孔庆鑫［31］用二酸钠、乙酸钠、酒石酸钾钠、葡萄糖、柠檬酸钠作为碳源分别对YY-5进行培养，发现YY-5在含乙酸钠、琥珀酸钠的培养基中脱氮效果最好，氨氮去除率达到100%；而王娟［26］筛选出来的YS-6以碳酸钙、碳酸钠、碳酸氢钠作为碳源时，发现以碳酸钙和碳酸氢化钠为混合碳源的效果最好，氨氮去除率达到最高（88.1%）。以上几个高效脱氮菌中的最佳碳源都不相同，而且有些菌株是单氮源，有些适合混合氮源，因此最佳碳源方面仍需进一步深入研究。

3.1.2 主要因素除碳源外，碳氮比、温度、pH等因素都会影响到菌株的脱氮效率，因此，探究这些因素对脱氮菌的应用前景具有重要意义。从表5可以看出，几乎所有硝化细菌的适宜碳氮比都在10左右，其中YN3和YY-5适宜碳氮比较高，分别为15和14；几乎所有硝化细菌适宜温度都在30～35℃，只有耐冷菌对温度要求不一样，如M-8的最适温度为2℃；几乎所有硝化菌生存环境都为中性或弱碱性，但有的硝化菌对pH的适应范围较宽，如HN-S，它在pH为5～9之间脱氮效果都比较理想；所有硝化菌的脱氮效率都高于90%，其中YY-5的脱氮效率最佳，几乎可以完全去除水中氮污染。这些学者们筛选出的耐受能力强的菌株，不仅在培养时有更强的生命力，而且对于实际水体的耐受能力也强，更容易推进生物脱氮技术治理农业氮肥污染的进程，对生物脱氮技术的发展有着重要的意义。

表5 硝化细菌最佳条件研究Table 5 Optimal conditions for nitrifying bacteria

3.2 反硝化细菌影响因素

3.2.1 碳源种类在反硝化细菌的研究中，碳源的作用更为强大，在反硝化反应过程中，碳源不仅为菌株提供营养物质，有机碳还为反硝化反应提供能源和电子［46］。李紫惠［39］发现的高效反硝化细菌XH02，分别使用丁二酸钠、葡萄糖、蔗糖和柠檬酸三钠为碳源进行最佳碳源的研究，发现以柠檬酸三钠为单一碳源时效果最好，对亚硝态氮和硝态氮的去除率分别为100%和94.8%；孙智毅［37］对培养出的菌株S1分别以乙酸钠、丁二酸钠、柠檬酸钠、延胡索钠、苹果酸钠为碳源进行研究，发现最适碳源是丙酮酸钠，18 h的脱氨氮效率达到99.1%；刘胜格［41］发现的FX-11的碳源更为广泛，以乙酸钠、葡萄糖、淀粉为碳源时，它对总氮的去除率在80%以上，但以酒石酸钾钠、柠檬酸钠、纤维素等为碳源时对总氮的去除率低于50%。

在本次研究中，我们还发现一株能以苯为碳源的菌株PDB3，它以苯为唯一碳源时，在最适条件下对苯的去除率高达100%，对总氮的去除率为52.3%［47］。这表明某些脱氮菌不仅能治理废水中的氮污染，还能治理其他污染因子，对污水治理有重要的潜在价值。

3.2.2 主要因素从反硝化细菌最佳条件（表6）可以看出，这些反硝化菌适宜碳氮比在3.0～14.9之间，其中G16X-D适宜碳氮比最小、为3，ADH1适宜碳氮比最大、为14.9；大多数反硝化细菌最适温度在30～35℃之间，但DL-23和ADH1适宜温度较高、为37℃；这些反硝化菌适宜pH值在5.7～9.0之间，大多数都比较适应弱碱性环境，只有G16X-D可以适应酸性环境；大多数反硝化菌的脱氮效率都在90%以上，其中ZH-1的脱氮效率最高、为100%。由此可见，大多数脱氮菌的最适碳氮比在8左右，温度在30℃左右，喜欢中性或弱酸弱碱性环境，这为未来脱氮菌的培养提供了的理论依据。

表6 反硝化细菌最佳条件研究Table 6 Optimal conditions for denitrifying bacteria

3.3 其他因素

除了碳源及主要因素外，菌株生存环境其他因素（如水体中其他污染、重金属、盐度等）也会影响其生长。路泽洋［48］探究了重金属Cu和Zn对脱氮菌效率的影响，当Cu浓度为0.05 mmol/mol时脱氮效率迅速下降，Cu浓度为0.1 mmol/mol时基本丧失脱氮能力；而在Zn浓度低于0.5 mmol/mol时，Zn对脱氮反应有促进效果，但是高于0.5 mmol/mol便开始抑制。王洪娟［49］发现随着盐度增加，污水中有机物和氨氮降解速率明显降低。因此，学者们在实验室筛选出高效脱氮菌后，探究其对外界因素的耐受能力也是很有必要的。

4 脱氮菌的应用

4.1 单菌脱氮应用研究

在传统脱氮工艺上，硝化过程和反硝化过程分别在不同的反应池中进行。但随着学者们对脱氮菌的致力研究，越来越多同步硝化反硝化菌株被发现，王永红等［50］在养殖水体发现了能同步硝化反硝化的菌株j-1，在最适条件下对亚硝态氮、硝态氮和氨氮的去除率均在99%左右；白洁等［51］在沼液中发现菌株GK-1也有同步硝化反硝化能力，在最佳条件下对氨氮的去除率为99.08%，对硝态氮的去除率为96.12%。这表明具有同步硝化反硝化能力的菌株，能在同一个反应器中达到脱氮效果，大大节约了工程占地面积和成本，促进了脱氮菌工业化应用发展。

4.2 混合菌脱氮应用研究

混合菌的研究分为3种情况，第一种是硝化细菌之间的混合研究，第二种为反硝化细菌之间的混合研究，第三种是硝化菌与反硝化菌之间的混合研究。刘胜格［41］在淤泥中筛选出FX-2和FX-11两株高效反硝化细菌，FX-2在最佳条件下对总氮的去除率为73.15%，FX-11在最佳条件下对总氮的去除率为81.34%，将两个菌混合，在最佳条件下对总氮的去除率达到90%，说明菌株之间会有协同作用，在没有竞争的环境下，比单菌株的脱氮能力更强。Deng等［52］将筛选出来的高效反硝化菌SC221-M和BSC24投入养殖水体进行脱氮实验，9 d后发现BSC24的脱氮率为24.5%，SC221-M的脱氮率为26.6%，效率均非常低，但是将SC221-M和BSC24混合后投放，脱氮效率达到了53.9%，效率是单菌株的2倍。司文攻［27］将筛选出来的硝化菌HN-S和反硝化菌DN-S进行组合探究，在最佳条件下，发现两种菌组合之后脱氮能力明显加强，对总氮的去除率达到94.3%，可见，在菌株间没有竞争的情况下，混合菌的脱氮效率比单菌株要高。如图2所示，就处理水体氮污染效果而言，单一菌株＜同步硝化反硝化菌＜多种硝化细菌的复合＜多种硝化菌与反硝化菌的复合；就实用性而言，单一菌株＜同步硝化反硝化菌＝多种硝化细菌的复合＜多种硝化菌与反硝化菌的复合，但并不是所有菌株组合起来都能加强其脱氮效果，因此混合菌的应用仍需进一步探究。

5 结语

农业工程化推动了我国农业进步，大大提高了农业生产力，但背后造成的影响不可忽视，在经济发展的同时，环境治理问题仍是我国未来研究的重点。生物脱氮技术的核心是高效脱氮菌，高效脱氮菌可以从很多环境中筛选出来，如污水处理厂中的污泥、地浸场轴孔的浸出液及人工湿地的土壤等，但由于自然界的复杂性导致并不是每种菌都能适用于自然水体，而且在流动水域中菌株随水流失的影响，使脱氮菌的实际应用变得更为棘手，因此需要对脱氮菌的实际应用进行更为广泛的研究，寻找合适载体和脱氮菌固定化技术将成为未来研究的重点。

影响脱氮菌性能的因素有很多，除本文探究的因素外，还有其他因素会影响脱氮菌的脱氮效果。在已知因素方面，我们要进一步探究其影响规律和脱氮菌适宜条件规律。同时探究是否还有其他影响脱氮菌性能的因素，进一步研究脱氮菌的最佳脱氮条件。混合脱氮菌比单菌更适合应用于现实治理问题，研究各种菌之间的组合、配比，发现更多的高效菌株组合，对推动生物脱氮技术治理农业污染问题的进程有积极影响。