HPLC同时测定归芍疏肝散中芍药苷 阿魏酸和甘草酸铵的含量

荀秀彪，张顺平

云南省曲靖市食品药品检验检测中心，云南 曲靖 655000

归芍疏肝散是曲靖市中医医院传统院内制剂，由柴胡、白芍、白术(炒)、当归、茯苓、薄荷、甘草(蜜炙)7味药制得，具有疏肝健脾、养血调经的功效，用于治疗肝气不舒、胸胁胀痛、头晕目眩、食欲减退、月经不调等症。其现行质量标准[1]中仅有当归药材的定性鉴别，无含量测定，由于处方中白芍为君药，具有养血调经、柔肝止痛之功效；当归作为臣药，具有补血活血、调经止痛之功效；甘草作为使药，具有调和诸药之功效[2]。本实验通过查阅文献[3-6]和反复摸索，建立了HPLC同时测定归芍疏肝散中芍药苷、阿魏酸和甘草酸铵的含量。该方法易操作，专属性及重复性较好，测定结果准确可靠，可用用于该制剂的质量控制。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1200型高效液相色谱仪(四元泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器)；KQ-300UDB型双频数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；MS205DU电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；一体式超纯水仪(PURELAB Flex 3，英国ELGA公司)。

1.2 试药

归芍疏肝散(规格：6 g/袋，批号分别为：180801、181002、190110、190318、190419)样品均来自云南省曲靖市中医医院；芍药苷对照品(批号：110736-201741，纯度：95.7%)、阿魏酸对照品(批号：110773-201614，纯度：99.0%)、甘草酸铵对照品(批号：110731-201619，纯度：93.0%)均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯；甲醇和磷酸为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Amethyst C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸为流动相B，梯度洗脱(0～15 min，15%～85%A；15～40 min，40%～60%A；40～50 min，15%～85%A)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：237 nm；进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液制备 分别精密称取芍药苷对照品37.54 mg、阿魏酸对照品27.11 mg、甘草酸铵对照品10.37 mg，置同一10 mL容量瓶中，加甲醇使其溶解并稀释至刻度，摇匀，制得混合对照品储备溶液(每1 mL中含芍药苷3.592 6 mg、阿魏酸2.683 9 mg和甘草酸铵0.964 4 mg)，再精密量取上述对照品储备溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度(每1 mL中含芍药苷0.359 3 mg、阿魏酸0.268 4 mg和甘草酸铵0.096 44 mg)，即得混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液制备 取装量差异项下的内容物，研细，取约2.0 g，精密称定，置50 mL容量瓶中，加入甲醇35 mL超声提取30 min，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，续滤液再用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2.3阴性样品溶液制备 根据制剂处方及工艺，分别制备缺当归、缺白芍和缺甘草的3份阴性样品(由云南省曲靖市中医医院提供)，再按2.2.2项下方法制备阴性样品溶液。

2.3 结果

2.3.1专属性试验 在上述色谱条件下，分别精密吸取供试品溶液、混合对照品溶液和阴性样品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图1。结果表明，芍药苷、阿魏酸和甘草酸铵分离较好，无干扰，说明测定方法专属性较好。

注：A.混合对照品；B.供试品；C.缺白芍阴性对照品；D.缺当归阴性对照品；E.缺甘草阴性对照品；1.芍药苷；2.阿魏酸；3.甘草酸铵。图1 归芍舒肝散HPLC图

2.3.2线性关系试验 精密吸取2.2.1项下的混合对照品溶液0.05、0.1、0.2、0.4、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。分别重复进样3次，记录峰面积。以进样量(X)为横坐标，峰面积平均值(Y)为纵坐标，进行线性回归，芍药苷：Y=7 805.308 2X+28.913 0，r=0.999 8；阿魏酸：Y=4 281.078 1X-18.378 5，r=0.999 9；甘草铵酸：Y=3 219.337 9X-2.610 0，r=0.999 8。结果表明，芍药苷进样量在0.359 3～5.388 9 μg，阿魏酸进样量在0.268 4～0.402 6 μg，甘草酸铵进样量在0.096 44～0.144 7 μg线性关系良好。

2.3.3检测限和定量限 取2.2.1项下的混合对照品溶液适量，等倍逐级稀释，进样测定6次，记录峰面积。当信噪比为3∶1时，得检测限分别为：芍药苷0.31 ng、阿魏酸0.71 ng、甘草酸铵1.02 ng；当信噪比为10∶1时，得定量限分别为：芍药苷1.01 ng、阿魏酸2.13 ng、甘草酸铵3.11 ng。

2.3.4稳定性试验 取经2.2.1项方法制备(批号：190110)供试品溶液，按照2.1项下的色谱条件进行分析，分别在0、4、8、16、36、48 h进样测定。结果芍药苷、阿魏酸和甘草酸铵峰面积RSD分别为0.36%、0.42%和0.31%。结果表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.3.5回收率试验 精密称取已知含量的同一批样品(批号：190110)9份，每份约1.0 g，分别精密加入低、中、高3种不同浓度(相当于供试品溶液浓度的50%、100%、150%)的混合对照品溶液，分别按2.2.2项下的方法制备供试品溶液，每个浓度制备3份，按照2.1项下的色谱条件进行分析，结果见表1。

表1 归芍疏肝散中3种成分回收率试验结果(n=9)

2.3.6精密度试验 精密取经2.2.1项方法制备的样品(批号：190110)供试品溶液10 μL，按照2.1项下的色谱条件进行分析，连续6次。结果芍药苷、阿魏酸和甘草酸铵峰面积的RSD分别为0.30%、0.21%、0.14%，结果表明仪器平行精密度良好。

2.3.7重复性试验 精密称取样品(批号：190110)6份，每份2.0 g。按2.2.1项下的方法制备供试品溶液，按照2.1项下的色谱条件进行分析，每1 g样品中含芍药苷7.230 2 mg，RSD为0.26%；含阿魏酸6.011 2 mg，RSD=0.36%；含甘草酸铵4.623 6 mg，RSD=0.31%，结果表明该方法重复性良好。

2.3.8样品测定 取样品5批次(批号分别为：180801、181002、190110、190318、190419)，分别按2.2.1项下的方法制备供试品溶液，按照2.1项下的色谱条件进行分析，样品中芍药苷、阿魏酸、和甘草酸铵的含量结果见表2。

表2 归芍疏肝散供试品含量测定结果(n=5)

3 讨论

3.1 检测成分选择

白芍、当归、甘草为处方中的主要药效药材，现行标准中尚无对其含量进行测定。因此，本实验选取方中的有效成分芍药苷、阿魏酸和甘草酸铵进行定量测定分析研究。单独对芍药苷、阿魏酸和甘草酸铵进行定量分析已有相关报道[7-9]，本实验采用一测多评法同时测定芍药苷、阿魏酸和甘草酸铵3个成分含量，更能有效控制其质量。

3.2 提取条件选择

实验中曾采用70%甲醇、甲醇-水、乙醇等溶媒进行提取，结果发现，甲醇效果最好；采用直接超声提取、索氏提取、加热回流提取方法提取3 h，发现三者差异不大；再比较超声提取15、30、45、60 min，发现超声30 min后提取效率没有明显提高。综合考虑，选择提取方法为甲醇超声提取30 min。

3.3 分离条件选择

本实验曾采用了3种方法进行成分分离[10-13]：1)乙腈-0.1%磷酸梯度洗脱；2)甲醇-水梯度洗脱；3)乙腈-0.1%冰醋酸梯度洗脱，结果发现第二种方法检测不到阿魏酸，采用乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脱保留时间合适且各成分获得较好的分离。

3.4 检测波长选择

参考《中华人民共和国药典》及相关文献[14-16]，分别在230、237、275、316 nm波长下进行测定考察，结果发现在237 nm下芍药苷、阿魏酸和甘草酸铵均能获得较好的信号响应。

3.5 小结

本实验中采用了多波长对芍药苷、阿魏酸和甘草酸铵进行测定，由于多波长对仪器要求较高，且在237 nm波长下能达到较好效果，因此最终选择单波长进行测定；对梯度洗脱的选择进行了多次实验，亦是本实验实现3个成分同时测定的关键因素，随着技术的不断发展，今后可能探索更多成分的同时测定。