牛骨骼肌肌钙蛋白T单克隆抗体的制备及其特性鉴定

刘静静，李玉静，王振华，张静，吴萌，杜顺丰，张岩，李春生，

（1.河北省科学院生物研究所，河北 石家庄 050081；2.河北交通职业技术学院，河北 石家庄 050035；3.河北科星药业有限公司，河北 石家庄 050200；4.秦皇岛市农产品质量安全监督检验中心，河北 秦皇岛 066001；5.河北省食品检验研究院，河北 石家庄 050227）

肉类是餐桌上最受欢迎的食材之一，营养丰富，味道鲜美，是百姓食谱中不可缺少的营养食材。随着社会发展、生活水平的提高，肉类食品的种类和数量与日俱增，掺杂掺假行为屡见不鲜。例如一些不法商家为了追求利益，用价格便宜的鸡、鸭肉冒充牛、羊肉[1]；在清真肉品中掺加猪肉更是严重冒犯了伊斯兰教消费者，影响民族团结[2]。这些掺假行为极大地损害了消费者的利益，也成为了政府监管和民生关注的焦点，质检“十三五”规划纲要明确指出要重点加强开展食品掺假鉴别技术研究。

目前，肉类的鉴别方法主要有显微镜观察法，通过肉类食品的纹理、色泽、味道等进行判别[3]；蛋白质检测法，如等电聚焦电泳法、免疫分析法、酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）[4-6]；DNA 检测法，如核酸探针杂交、限制性片段长度多态性聚合酶链式反应（polymerase chain reaction-fragmentlength polymorphism，PCR-RFLP） 分析、DNA 指纹分析和PCR 特异扩增[7-10]。显微镜鉴别方法需要丰富的经验，主观性比较强。对于熟肉制品，由于在热加工过程中，DNA 会发生降解，在120 ℃左右时就会锐减到600 bp 以下[11]，高温对遗传物质有一定的破坏，利用DNA 方法无法准确判断肉类的来源。免疫学方法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定、适用范围宽及费用低等优点，已成为食品安全检测中最为广泛应用的方法之一[12]，与此同时，耐热性标志蛋白的研究发现进一步促进了该方法在肉源成分鉴定上的应用价值[13-14]。Fur-Chi Chen 等获得了一株针对猪的肌肉热稳定蛋白的特异性单抗，并建立了间接ELISA 方法，可以用于生肉、熟肉中添加猪肉的检测[15]。20 世纪60年代研究发现，原肌球蛋白溶液中一种未知的蛋白质，即使在原肌球蛋白经过等电点沉淀处理之后仍旧存在，后来被命名为肌钙蛋白[16]。肌钙蛋白是一个结构不太稳定的复合体，主要由肌钙蛋白 C（troponin C，TnC）、肌钙蛋白 I（troponin I，TnI）和肌钙蛋白 T（troponin T，TnT）3 种不同的亚型组成[17-18]。本研究以牛骨骼肌肌钙蛋白T（skeletal muscle troponin T，sTnT）为标志蛋白，制备其单克隆抗体，并对抗体的效价、特异性等进行鉴定，为食品中牛肉源性成分免疫学鉴别方法的建立奠定了基础，为实现肉类食品的快速鉴定、加强市场监管提供有利保障。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

丙烯酰胺（Acr）、亚甲基双丙烯酰胺（Bis）、甘氨酸、十二烷基硫酸钠、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、HAT Media Supplement（50×）Hybri-MaxTM、HT Media Supplement（50×）Hybri-MaxTM、福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、免疫球蛋白亚型试剂盒：Sigma 公司；四甲基乙二胺（N，N，N'，N'-tetramethylethylenediamine，TEMED）：美国 BBI 公司；细胞培养板、DMEM 培养基：GIBCO 公司；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记羊抗小鼠IgG：北京中杉金桥生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯；Balb/c 小鼠：河北医科大学实验动物中心。

1.2 仪器与设备

4710 型超声破碎仪：Cole-Parmer Instrument 公司；Heraus Multifuge 高速冷冻离心机、ND2000 超微量核酸蛋白测定仪、1510 型酶标仪：德国Thermo 公司；MCO-15AC 二氧化碳培养箱：日本SANYO 公司；SWCJ-2FD 型净化工作台：苏州净化设备有限公司；CKX41SF 倒置显微镜：日本OLYMPUS 公司。

1.3 方法

1.3.1 抗原的提取

取牛的骨骼肌去除脂肪和结缔组织，研磨混匀，称取 40 g 加入 0.15 mol/L 的 NaCl 溶液（1∶2，质量体积比）；进一步混匀后，超声提取 5 min（50 W，20 KHz），煮沸 20 min 后，2 000 g 离心 30 min；去除沉淀，取一半上清过滤后为检测原。另一半上清经121 ℃高压30 min 后，5 000 g 离心 30 min；取上清用 Whatman 1 号滤纸过滤，滤液加入 90%乙醇（1∶3.74，体积比），静置2 h；混合液7 000 g 离心20 min，取沉淀烘干，作为免疫原提取物，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）后切胶用于免疫。

1.3.2 SDS-PAGE 鉴定

选择分离胶浓度为12%，浓缩胶为5%，对抗原进行SDS-PAGE 鉴定。

1.3.3 动物免疫

免疫原提取物切胶于Balb/c 小鼠颈背部注射，每隔2 周加强一次免疫。3 次免疫后7 d～10 d 断尾取血，间接ELISA 检测血清抗体效价。选取免疫效果最佳的小鼠进行细胞融合。

1.3.4 单克隆抗体的制备

采用PEG 法融合。融合7 d 后，细胞集落约显微镜下1/3～1/2 视野大小时换用HT 培养基。上清液用间接ELISA 方法检测，进行阳性杂交瘤细胞筛选。检测为阳性的孔，尽量挑选出阳性较高的单个克隆，通过有限稀释法进行亚克隆，直至建立单一分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。小鼠体内诱生腹水，辛酸-硫酸铵沉淀的方法纯化。

1.3.5 单克隆抗体特性鉴定

1.3.5.1 单克隆抗体效价测定

采用间接ELISA 法进行抗血清效价测定，具体步骤如下：检测原浓度为5 μg/mL，96 孔酶标板每孔100 μL，4℃包被过夜；包被板恢复至室温（24 ℃），倾去包被液，洗3 次～4 次，拍干；封闭，每孔加含10%明胶的洗液作为封闭液，37 ℃孵育2 h；洗涤，拍干；将单抗以1 000 倍开始倍比稀释，每孔加入100 μL，并且设置空白对照孔（0.01 mol/L，pH7.4 的磷酸盐缓冲液）和阴性孔（阴性血清），37 ℃孵育 45 min；洗涤，拍干；每孔加入 100 μL 的 1∶10 000（体积比）稀释的 HRP 酶标记的山羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育30 min；洗涤，拍干；每孔加底物显色液100 μL，37 ℃避光反应15 min；每孔加入50 μL 终止液，终止反应；450 nm 测定吸光度值，阴性对照孔吸光度值为N，阳性为P，以P/N≧2.1，为阳性结果。

1.3.5.2 单克隆抗体亚型测定

用Sigma 公司的免疫球蛋白亚型试剂盒进行测定。

1.3.5.3 单克隆抗体特异性的测定

用间接ELISA 测定单克隆抗体与牛、羊、鸡、鸭、鱼的骨骼肌提取物的交叉反应。牛、羊、鸡、鸭、鱼的骨骼肌提取物的制备方法同1.3.1 中抗原的提取方法。

1.3.5.4 免疫印迹

SDS-PAGE 电泳后转膜，转膜后经封闭、洗膜，加入稀释的辛酸-硫酸铵纯化的抗体，洗膜后加入稀释的HRP 酶标记的山羊抗小鼠IgG，洗膜后加入显色液拍照。

1.3.5.5 单克隆抗体亲和力测定

采用间接ELISA 法测定亲和常数Ka。

2 结果与分析

2.1 抗原的提取

牛骨骼肌提取后，得到固体物质90.5 mg，得率为0.45 %，蛋白质含量经考马斯亮蓝G-250 法测定为67.5%。检测原浓度用超微量核酸蛋白测定仪测定为8.8 mg/mL。

2.2 SDS-PAGE鉴定结果

检测原和免疫原的SDS-PAGE 结果见图1。

图1 提取物的SDS-PAGE 的鉴定结果Fig.1 Identification results of SDS-PAGE of extracts

从图1 中可见，带形清晰，颜色较深的有3 条，对应的分子量约为37、24、17 kDa，与文献中报道的骨骼肌肌钙蛋白 T、I、C 亚基相符[19-21]。选取 37 kDa（sTnT）用于免疫。免疫原提取物与检测原相比，17 kDa 处无明显条带，可能是经过高压的处理后被沉淀了。

2.3 杂交瘤细胞株的筛选

融合后出现肉眼可见细胞集落时，取上清进行间接ELISA 检测，取阳性孔经过3 次～4 次克隆，直至全阳性。筛选出单克隆抗体细胞株2 株，分别命名为3A8、1B8。

2.4 单克隆抗体效价测定

单克隆抗体的浓度和效价检测结果见表1。

表1 单克隆抗体部分性能的测定Table 1 Determination of monoclonal antibody performance

由表1 可知，纯化后经间接ELISA 测定效价，3A8 效价在 1∶1.0×106以上，1B8 效价较低，为 1∶3.2×104。用超微量核酸蛋白测定仪测定蛋白含量，3A8 为20.6 mg/mL，1B8 为 16.9 mg/mL。

2.5 单克隆抗体亚型测定

单抗3A8、1B8 亚型的测定结果见图2。

图2 单克隆抗体亚型的测定Fig.2 Determination of monoclonal antibody subtype

由图2 可知，采用间接ELISA 方法测定2 株单克隆抗体的亚类。杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体与不同亚类的抗体显色有明显差异，其中3A8、1B8 与IgG1抗体的A450nm值最高，与IgM 的抗体A450nm值较低，在0.25 左右，而与 IgG2a、IgG2b、IgG3 和 IgA 抗体反应为阴性，所以3A8、1B8 分泌的抗体类型以IgG1 为主。

2.6 单克隆抗体特异性的测定

单抗3A8、1B8 与牛、羊、鸡、鸭、鱼骨骼肌提取物的间接ELISA 检测结果见图3。

由图3 可知，3A8 与牛、羊骨骼肌提取物的效价1∶1×106，与鸡、鸭、鱼骨骼肌提取物的效价低于 1∶1×104，特异性较好；1B8 与牛、羊、鸡、鸭、鱼骨骼肌提取物的效价都比较低，抗体性能较差。经过筛选，3A8 特异性较好，可用于下一步试验。

图3 单抗交叉反应结果Fig.3 Results of cross reaction of monoclonal antibody

2.7 免疫印迹

单抗3A8 的免疫印迹结果见图4。

图4 3A8 与骨骼肌提取物特异反应的免疫印迹图谱Fig.4 Immunoblot analysis of specific response of 3A8 to skeletal muscle extract

由图4 可知，单抗3A8 分别与转印有牛、羊、鸡、鸭骨骼肌提取物的聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜反应，显色后仅在牛、羊骨骼肌提取物的37 kDa 条带位置出现单一区带，而与鸡、鸭骨骼肌提取物无明显条带，初步证实3A8 能结合牛、羊骨骼肌提取物，主要结合骨骼肌肌钙蛋白T 亚基，不与鸡、鸭骨骼肌提取物结合。

2.8 单克隆抗体亲和常数测定

单抗3A8 亲和常数的测定结果见图5。

图5 单抗3A8 的亲和力测定Fig.5 Determination of affinity of 3A8

由图5 可知，以抗体浓度的对数为横坐标，以A450nm值为纵坐标，绘制S 型曲线，经计算，亲和常数为8.1×108L/mol，表明抗体的亲和力较高。

3 结论

本试验将牛骨骼肌粗提后，切胶免疫小鼠进行融合，筛选高效价、高特异性的单克隆抗体，最后获得稳定分泌抗牛sTnT 抗体的细胞株2 株。通过小鼠体内诱生腹水，用辛酸-硫酸铵沉淀的方法对其进行了纯化，制备出单克隆抗体。经过鉴定，单抗3A8 特性较好，亚型为 IgG1 型，与牛、羊骨骼肌提取物的效价 1∶1×106，与鸡、鸭、鱼骨骼肌提取物的效价低于 1∶1×104，特异性好。亲和常数为8.1×108L/mol，亲和力较高。免疫印迹结果显示单抗3A8 结合牛羊的sTnT 亚基，能够区分牛羊和鸡鸭的骨骼肌提取物，为食品中牛肉源性成分免疫学鉴别方法的建立奠定了基础。