沙蚕多糖提取工艺及抗氧化活性研究

金立新，陈丽，3，，高仁姣，鲍佳琦，吴海龙，饶杰，张硕

（1.淮海工学院海洋生命与水产学院，江苏 连云港 222005；2.江苏省海洋生物资源与环境重点实验室，江苏 连云港 222005；3.江苏省海洋资源开发研究院，江苏 连云港 222005）

沙蚕属于环节动物多毛纲沙蚕属。我国沙蚕种类丰富，约有80 余种，主要分布于东部沿海河口滩涂地带。沙蚕营养价值高，干品中粗蛋白占60%以上，氨基酸种类齐全，人体必需氨基酸和呈味氨基酸含量高[1-2]，有“天然味精”之称。沙蚕的纤维蛋白溶解酶、金属蛋白酶、抗凝血肽等能预防高血压、动脉硬化、脑血栓等疾病[3-5]，还有丰富的高不饱和脂肪酸[6]、羟氨酸，被誉为海中的“冬虫夏草”[7]，具有很好的开发利用前景。江苏沙蚕分布量多，约占全国总量的1/3，但目前沙蚕研究多为水产养殖饵料[8-9]、环境指示生物[10-11]等，沙蚕多糖、多肽等活性物质研究和高值化产品研发报道较少。海洋生物多糖具有抗肿瘤、免疫促进、降血糖、抗氧化等活性[12-16]。沙蚕是重要的环境指示生物，在耐受重金属及有机质污染时表现出较强的抗氧化性[17]，本研究提取沙蚕多糖并测定其抗氧化活性，以期为沙蚕的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

沙蚕：捕于连云港海州湾海域，洗净冻干粉碎，75 %乙醇脱脂，烘干至恒重；DPPH 试剂：上海跃腾生物技术有限公司；抗坏血酸：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醇、蒽酮、氯仿、正丁醇、双氧水、浓硫酸、冰乙酸、无水葡萄糖（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；羟自由基试剂盒、超氧阴离子自由基试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

Freezone 6 PLus 冷冻干燥机：美国Labconco 公司；JP-300A 型高速粉碎机：永康市久品工贸有限公司；BS323S 电子分析天平：赛多利斯科学仪器有限公司；MuLtifuge X3R 高速冷冻离心机：赛默飞世尔科技有限公司；OSB-2100 旋转蒸发仪：上海泉杰仪器有限公司；MS-PB 磁力搅拌器：美国SCILOGEX 公司；DHG-9240A 电热鼓风干燥箱：上海易研实验设备有限公司；1510 酶标仪：美国Thermo Fisher 公司。

1.3 方法

1.3.1 沙蚕粗多糖提取

采用水提醇沉法。准确称取沙蚕粉10 g 放入三角瓶中，加入适量蒸馏水浸提，分别按照试验设置的提取温度、提取时间、料液比，恒温搅拌，离心收集上清液，重复提取2 次，上清液过滤，滤液减压浓缩至原体积的1/20 后，加4 倍体积95%乙醇沉淀12 h，沉淀经无水乙醇洗涤，恒温干燥得粗多糖。

1.3.2 沙蚕多糖含量测定

采用蒽酮-硫酸法[18]。以葡萄糖为标准物做标准曲线。配制1 mg/mL 沙蚕粗多糖溶液，测定620 nm 处的光密度值，由回归方程计算得到沙蚕多糖含量X。

1.3.3 沙蚕多糖提取率计算

沙蚕多糖提取率Y/%=W1×X/W×100

式中：W1为测定用沙蚕粗多糖重量，g；X 为沙蚕粗多糖中的糖含量，%；W 为提取用沙蚕粉重量，g。

1.3.4 沙蚕多糖提取单因素条件试验

分别设置不同提取温度（60、70、80、90、100 ℃）、提取时间（1、2、3、4、5 h）和料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40 和 1∶50（g/mL）]，根据 1.3.1 方法，提取沙蚕多糖。提取到的多糖根据1.3.2 方法测定糖含量后，计算提取率。

1.3.5 沙蚕多糖提取工艺的响应面法优化

在单因素试验基础上，采用Box-Behnken 设计三因素三水平试验，并用响应面法分析优化提取条件。

1.3.6 沙蚕多糖体外抗氧化活性测定

分别配制系列浓度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mg/mL） 的脱蛋白沙蚕多糖溶液，以VC溶液作阳性对照，按以下方法分别测定不同浓度沙蚕多糖对不同自由基的清除能力。

1.3.6.1 羟自由基清除能力测定

采用羟自由基测定试剂盒测定。羟自由基清除能力的定义：规定每毫升沙蚕多糖溶液于37 ℃反应1 min，使体系中H2O2浓度下降1 mmol/L 为一个清除能力单位。

式中：V 为样品测定用的体积，mL；N 为样品测试前稀释倍数。

式中：OD 为 550 nm 波长处的光密度值；V 为样品测定用的体积，mL；N 为样品测试前稀释倍数。

1.3.6.2 超氧阴离子自由基清除能力测定

采用超氧阴离子自由基测定试剂盒测定。超氧阴离子自由基清除能力的定义：在反应系统中，每毫升多糖溶液于37 ℃反应40 min 所抑制的超氧阴离子自由基相当于1 mg 的维生素C 所抑制的超氧阴离子自由基的变化值为一个活力单位。

式中：OD 为450 nm 波长处的光密度值；N 为样品测试前稀释倍数。

1.3.6.3 DPPH 自由基清除能力测定

取棕色 EP 管 3 支，编号，1 号管加 200 μL 多糖溶液和200 μL 0.2 mmol/L DPPH 溶液，混匀，避光反应30 min 后离心取上清液，测OD517，记作 A1；2 号管加200 μL 多糖溶液和 200 μL 无水乙醇混匀，测 OD517，记作 A2；3 号管加 200 μL 无水乙醇和 200 μL 0.2 mmol/L DPPH 溶液混匀，测 OD517，记作 A3。以 VC作阳性对照，取不同浓度沙蚕多糖均按以上操作分别测定DPPH 自由基清除能力。

2 结果与分析

2.1 沙蚕多糖提取的单因素试验结果

2.1.1 温度对沙蚕多糖提取的影响

温度对沙蚕多糖提取率的影响见图1。

图1 温度对沙蚕多糖提取的影响Fig.1 Effect of temperature on the extraction yield of PNS

由图1 可知，温度在 60 ℃～90 ℃范围内，沙蚕多糖提取率随温度增加而提高，90 ℃时达到最大值，高于90 ℃后提取率开始下降。因此选择90 ℃为沙蚕多糖提取的最适温度。

2.1.2 时间对沙蚕多糖提取的影响

时间对沙蚕多糖提取率的影响见图2。

图2 时间对沙蚕多糖提取的影响Fig.2 Effect of time on the extraction yield of PNS

由图2 可知，多糖提取率随提取时间延长而不断增加，在3 h 前增加较明显，后趋于平缓，因此，选择沙蚕多糖提取的时间为3 h。

2.1.3 料液比对沙蚕多糖提取的影响

提取时间3h、提取温度90 ℃条件下，料液比对沙蚕多糖提取率的影响见图3。

由图3 可知，沙蚕多糖提取率随加水量增加而逐渐增大，1∶30（g/mL）后，提取率变化不明显，说明水分增加有利于多糖的提取，但加水量过大，会增加后续浓缩难度，因此选择沙蚕多糖提取的料液比为1∶30（g/mL）。

图3 料液比对沙蚕多糖提取的影响Fig.3 Effect of material-liquid ratio on the extraction yield of PNS

2.2 沙蚕多糖提取工艺的响应面法优化

2.2.1 试验设计方案和结果

在单因素试验基础上，选择提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）为自变量，沙蚕多糖提取率（Y）为响应值，采用Box-Behnken 设计三因素三水平响应面分析试验，试验因素与水平设计见表1，试验结果见表2。

表1 响应面分析因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

表2 响应面试验分析方案及结果Table 2 Response surface analysis scheme and result

2.2.2 模型拟合

利用Design Expert 10.0.3 软件对表2 试验数据进行响应面分析，结果见表3，得到沙蚕多糖对提取温度（A）、料液比（B）、提取时间（C）的回归方程为：Y=1.75+0.027A+0.041B+0.041C-8.325×10-3AB-6.700×10-3AC+0.014BC-0.030A2-0.041B2-0.050C2。由表3模型的方差分析可知回归模型P 值＜0.01，说明本试验所采取的二次多项式模型极显著，失拟项P 值0.057 5＞0.05 不显著，回归模型的决定系数R2=0.977 9，R2Adj=0.949 5，说明模型的拟合度好，试验方法可靠，能够准确预测和分析多糖的提取率大小。提取温度A、料液比B 和提取时间C 对沙蚕多糖提取率均有显著影响，影响大小为料液比＞提取时间＞提取温度。两两因素交互影响AB、AC和BC 项不显著（P＞0.05），说明沙蚕多糖提取率受提取温度、料液比和提取时间之间交互作用的影响小。

表3 回归模型方差分析结果Table 3 Regression analysis results of variance analysis

2.2.3 响应面直观分析

根据回归方程，得到影响沙蚕多糖提取率的提取温度、料液比、提取时间等3 因素两两交互作用的响应曲面和等高线，结果见图4 至图6。

由图4 可知，沙蚕多糖提取率受提取温度和提取时间交互作用的影响较小，等高线图为椭圆形，说明沙蚕多糖提取率在合适的温度和提取时间下具有极大值。当将取温度固定，分析提取时间对沙蚕多糖提取率的影响，曲线先升高后下降，同样固定提取时间，沙蚕多糖提取率随提取温度的增大表现为先上升后下降，因此实际提取时应该控制提取温度和提取时间在最佳范围内。

图4 提取温度和时间交互作用对多糖提取率的响应面图与等高线图Fig.4 Temperature and time response surface and contour plot

图5 料液比和提取时间交互作用对多糖得率的响应面图与等高线图Fig.5 Material-liquid ratio and time response surface and contour plot

由图5 可知，沙蚕多糖提取率受提取时间和液料比交互作用影响较小，表现为响应面坡度较陡，响应面图均呈现抛物线型，等高线图为椭圆形说明沙蚕多糖提取率在合适的提取时间和液料比下具有极大值。因此在实际操作中可以适当增长提取时间增大料液比来提高多糖的得率。

由图6 可知，固定提取温度，沙蚕多糖提取率随液料比的增大表现为先急剧上升后缓慢下降，因此在实验中可以适当增大料液比。当固定液料比，沙蚕多糖提取率随温度的增大表现为先上升后下降。等高线图为椭圆形说明沙蚕多糖提取率在合适的提取温度下具有极大值。

2.2.4 验证试验

通过Design Expert10.0.3 软件分析得到提取温度为83.36 ℃、料液比为 1∶24.56（g/mL）、提取时间为 3.53 h条件下，沙蚕多糖的预测提取率为1.774%。由于实际操作的局限性，分别将提取温度、时间和料液比调整为 83 ℃、1∶25（g/mL）和 3.5 h。在此条件下多糖提取率为1.76%，与模型预测值相近，说明该模型有效，得到的沙蚕多糖提取条件具有应用价值。

图6 料液比和提取温度交互作用对多糖得率的响应面图与等高线图Fig.6 Material-liquid ratio and temperature response surface and contour plot

2.3 沙蚕多糖体外抗氧化活性测定

2.3.1 羟自由基清除能力测定

沙蚕多糖对羟自由基清除能力测定结果见图7。

图7 沙蚕多糖对羟自由基的清除作用Fig.7 Scavenging activity of PNS on hydroxyl radical

由图7 可知，沙蚕多糖对羟自由基有较强清除能力，多糖浓度在0.1 mg/mL～0.6 mg/mL 时，羟自由基清除率由18 %快速提高到71 %，之后趋于平缓，超过1 mg/mL 时，清除率开始下降。

2.3.2 超氧阴离子自由基清除能力测定

沙蚕多糖对超氧阴离子自由基清除能力测定结果见图8。

图8 沙蚕多糖对超氧阴离子自由基的清除作用Fig.8 Scavenging activity of PNS on superoxide radical

由图8 可知，多糖浓度在0.1 g/mL～1.8 g/mL 范围内，超氧阴离子自由基清除率随多糖浓度增加而升高，浓度大于1.8 mg/mL 后，清除率开始下降。多糖浓度为1.4 mg/mL 时，对超氧阴离子自由基的清除率可达到50%以上。

2.3.3 DPPH 自由基清除能力测定

沙蚕多糖对DPPH 自由基清除能力测定结果见图9。

图9 沙蚕多糖对DPPH 自由基的清除作用Fig.9 Scavenging activity of PNS on DPPH radical

由图9 可知，沙蚕多糖对DPPH 自由基具有较强清除能力，清除率随着多糖浓度增加而增大。多糖浓度为1.4 mg/mL 时，对DPPH 自由基的清除率达到50%以上。

3 结论

海洋多糖在食品添加剂[19-20]、保鲜剂[21]、药物载体[22]、水产养殖[23]、化妆品[24]等方面均有广泛应用。本文以多糖提取率为指标，在单因素试验为基础，采用响应面法，对沙蚕多糖提取的工艺进行优化，利用Design Expert10.0.3 程序软件对三元二次回归模型进行拟合分析，沙蚕多糖提取的最佳温度为83.36 ℃、料液比为 1∶24.56（g/mL）、时间为3.53 h，沙蚕多糖得率为1.774%。根据优化后条件，为温度为83 ℃、料液比为1∶25（g/mL）、时间为 3.5 h 得到沙蚕多糖提取率为（1.76±0.01）%，与模型预测值的误差较小，说明该模型能较好的预测沙蚕多糖的提取率，可用于沙蚕多糖提取率的预测。

沙蚕多糖对羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH 自由基均有较好的清除作用。对羟自由基的抑制效果最好，多糖浓度为0.6 mg/mL 时，对羟自由基的清除率超过70%；多糖浓度为1.4 mg/mL 时，对超氧阴离子自由基及DPPH 自由基的清除率都达到50%以上。本研究表明沙蚕多糖具有较强的体外抗氧化活性，可为沙蚕的高值化利用和产品开发提供一定依据。