植物乳杆菌发酵梨原汁饮料的研究

周印，刘梦阳，赵婧琦，王艳萍

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）

食品行业正在向方便食品及健康食品两个方面发展。由于益生菌在发酵过程中产生细菌素、胞外多糖、多酚类物质、酶等多种功效成分，使得发酵果蔬制品具有改善营养健康、调节胃肠道功能、提高免疫能力、抑制有害菌和抗氧化等作用[1-2]；而且经发酵的果蔬产品酸度增加、香气十足而赋予发酵产品一些特有的风味[3-4]，因此果蔬发酵制品是目前的研究热点，亦受到广大消费者的青睐，具有广阔的开发应用前景。

影响发酵果蔬制品的品质与功效存在两个关键因素：原料以及发酵菌株的选择[5]。发掘功能性菌株和优化发酵工艺是对研发发酵果蔬制品的重要措施[6]。梨果营养全面，具有多种对人体有益的功能[7]。采用多菌种的协同发酵是对梨果的充分开发。目前，大众消费者越来越关注食物的营养价值、健康价值，安全天然、无添加的果蔬发酵制品成为了消费者的最佳选择。因此，质优价廉的发酵果蔬制品的研发成为一大发展趋势。并且能够真正实现果蔬资源的全面利用，推动果蔬发酵产业的可持续发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

梨浆：宁波供享农业科技有限公司。菌种：植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）299、德氏保加利亚乳杆菌亚种 717（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）、嗜热链球菌 176（Streptococcus thermophilus）：保藏于天津科技大学食品工程与生物技术学院食品生物技术实验室。

MRS 培养基、脱脂乳粉（食品级）：雀巢有限公司；海藻糖（分析纯）：中国上海试剂二厂；谷氨酸钠、柠檬酸（分析纯）：天津市北方天医化学试剂厂；乳酸（分析纯）：天津市科密欧化学试剂开发中心；草酸（分析纯）：天津市化学试剂一厂；苹果酸（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂。

1.2 试验仪器试剂

Multiskan GO 型酶标仪：美国 Thermo 公司；LRH-250 生化培养箱：天津市达北实验仪器厂；L710A 型高效液相色谱仪：日本岛津公司；YC-015 型喷雾干燥机：上海雅程仪器设备有限公司；DELTA-320pH 计：法国 METTLER－TOLEDO 公司。

1.3 植物乳杆菌发酵剂的制备

1.3.1 工艺流程

植物乳杆菌发酵剂的制备工艺流程见图1。

1）菌种活化：在无菌条件下，从-80 ℃冰箱中取出已纯化好的菌样，活化两代后使用。

2）液体扩大培养，收集菌体：活化好的菌种，按4 %接菌量逐级扩大培养，最终在1 L MRS 液体培养基中进行培养，37 ℃，厌氧培养24 h 后，在8 000 r/min，4 ℃离心20 min，弃上清收集菌体。

3）活菌计数：采用梯度稀释平板计数法[8]。

1.3.2 冷冻干燥保护剂优化

选取海藻糖、谷氨酸钠、乳糖3 种物质与脱脂乳混合制备保护剂，为确定3 种物质的添加量，进行三因素三水平的正交试验，根据表1 设计的因素水平表进行分组试验，收集菌粉并测定活菌数。

图1 植物乳杆菌发酵剂制备工艺流程图Fig.1 Process flow chart of preparation of Lactobacillus plantarum starter

表1 保护剂正交试验因素水平表Table 1 Levels and factors in orthogonal test of protectant

1.3.3 菌体与保护剂配比确定

在以上最优条件下，菌泥与保护剂的混合比例分别按：3∶1、1∶1、1∶3、1∶5、1∶10（g/mL）的比例混合，进行冷冻干燥。收集菌粉并测定活菌数。

1.4 乳酸菌发酵梨浆工艺研究

1.4.1 理化指标测定

1）pH 值的测定：在 25 ℃条件下，参考 GB 5413.34-2010《食品安全国家标准乳和乳制品酸度的测定》，使用pH 计测定。

2）可溶性固形物的测定：利用手持式折光仪检测。

3）总酸的测定：参考GB/T12456-2008《食品安全国家标准食品中总酸的测定》，采用NaOH 常规滴定法。

1.4.2 感官评定的方法

发酵梨浆感官评分标准见表2。

感官综合评分为4 个指标之和，即感官评分（100分）=色泽评分（25 分）+香气评分（25 分）+口感评分（25 分）+组织状态评分（25 分），整个感官评价需 10 位评价员进行评价，统计评价结果，进行分析[9]。

1.4.3 发酵梨浆工艺单因素试验

1.4.3.1 发酵菌种的确定

取适量梨浆，85 ℃灭菌15 min、冷却，按表3 进行接种，发酵72 h 后测定产品pH 值和酸度，并进行感官评分[10]。

表2 感官评分标准Table 2 The standard of sensory evaluation

表3 发酵菌株和接种量Table 3 The strains of fermentation and inoculum concentration

1.4.3.2 菌种比例对发酵梨浆工艺的影响

分别按照植物乳杆菌299∶保加利亚乳杆菌717∶嗜热链球菌 176 体积比为 6∶1∶1、4∶1∶1、2∶1∶1、1∶1∶1、2∶3∶3 的比例进行接种，接种量为 8%、发酵温度为37 ℃、发酵72 h 后分别测定产品的pH 值和酸度，并对其进行感官评定。

1.4.3.3 接种量对发酵梨浆工艺的影响

按照植物乳杆菌299∶保加利亚乳杆菌717∶嗜热链球菌 176 体积比为 4∶1∶1 的比例进行接种，接种量分别为2%、4%、6%、8%、10%，发酵温度为37 ℃，发酵72 h 后分别测定产品的pH 值和酸度，并对其进行感官评定。

1.4.4 发酵梨浆工艺的正交试验

根据前期的试验结果，对菌种比例、发酵温度、接种量和发酵时间4 个因素进行正交试验，以感官评分作为评价标准。试验因素水平如表4 所示。

表4 发酵工艺因素水平表Table 4 Factors and their levels used in experiments of fermenting

1.5 乳酸菌发酵梨浆前后有机酸含量变化

采用高效液相色谱法对发酵前后有机酸含量进行测定[11]。

2 结果与讨论

2.1 冷冻干燥保护剂的优化

冷冻干燥试验设计及结果见表5。

表5 保护剂优化试验设计及结果Table 5 Design and results of the optimum of protectant

根据表1 的三因素三水平正交设计。得到结果如表5，R 值越大代表对结果影响越大。因此，这3 个因素中海藻糖对结果的影响较大，对植物乳杆菌菌粉的保护效果最佳。将3 个因素排序，保护效果依次为：海藻糖＞谷氨酸钠＞乳糖。通过比较均值，得到每个因素的最佳添加水平，最佳保护剂组成为：谷氨酸钠2%、海藻糖5%、乳糖5%、脱脂乳10%。

2.2 菌体与保护剂添加量比例的影响

将保护剂与菌泥分别按一定的比例混合，进行冷冻干燥，测定样品活菌数，结果如表6 所示。

表6 保护剂与菌泥比例的影响Table 6 The influence of proportion of protectant and cell

由表6可知，保护剂与菌泥为 3∶1（mL/g）时，样品的活菌数最高，为8.48×109cfu/g，当保护剂过少时，无法保护全部菌体，在干燥过程中菌体死亡，因此，样品中活菌数减少。当保护剂过多时，菌体样品不足，所以活菌数略有下降。

综上可知，在制备植物乳杆菌发酵剂时，冷冻干燥条件优化为：保护剂组成：谷氨酸钠2%、海藻糖5%、乳糖 5%、脱脂乳 10%、保护剂菌泥为 3∶1（mL/g）时，得到最终发酵剂，其活性为8.48×109cfu/g。

2.3 发酵梨浆菌种比例的确定

按照表3 发酵梨浆，结果如表7 所示。

表7 不同发酵剂对产品品质的影响Table 7 Influences of different strains of fermentation on quality of products

根据表7可知，a、b、c 3 组单一菌株发酵的产品在感官得分方面较低，而d、e、f、g 4 组混合菌株发酵产品在感官得分方面较高，因此采用复合菌株的发酵。在复合菌株发酵的产品中，产品的pH 值以及酸度之间无显著差异，根据感官评分，其中g 组得分最高，即植物乳杆菌299∶保加利亚乳杆菌717∶嗜热链球菌 176 体积比为1∶1∶1。这3 株菌的产酸能力都比较强，同时菌株717 还具有产香的功能，菌株176 则具有加快其产酸速度的能力[12]。复合菌株的使用，能够使发酵梨浆具有特有的香气及口感。因此，经过综合考虑，最终确定发酵梨浆饮料所用菌种为植物乳杆菌299、菌株 717、菌株 176，3 种菌复配的组合。

2.4 发酵梨浆菌种比例的确定

每株乳酸菌的发酵特性不同，对产品风味影响不同，因此，确定复合发酵中菌株的比例，能够有助于产品口感的改善。菌株体积比例按照植物乳杆菌299∶保加利亚乳杆菌717∶嗜热链球菌176 进行设计，对梨浆进行发酵。分别测定发酵72 h 后梨浆的pH 值和酸度，并对其进行感官评分，结果如图2 所示。

图2 菌种比例对发酵梨浆工艺的影响Fig.2 Effect of strain proportion on fermented pear juice process

由图2 可知，当植物乳杆菌所占的比例减少时，发酵梨浆pH 值升高，酸度降低，这是由植物乳杆菌生长速度快且产酸能力强的特点产生的结果[13]。保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌菌在发酵过程中，主要是起到增香的作用。综合以上指标考量，最终确定发酵梨浆菌种体积比例为植物乳杆菌299∶保加利亚乳杆菌717∶嗜热链球菌 176=4∶1∶1。

2.5 发酵梨浆接种量的确定

适当的发酵菌株接种量有助于乳酸菌充分利用底物，对梨浆进行发酵。采取5 个不同的接种量对梨浆进行发酵，进行发酵产品品质检测并对发酵后的梨浆进行感官评分，结果如图3 所示。

图3 接种量对发酵梨浆工艺的影响Fig.3 Effect of inoculation amount on fermented pear juice process

由图可知，在相同的时间中，接种量越大，发酵产物pH 值越小，酸度越高。当接种量过低时，产品风味不足，口感不佳，感官评分低。当添加量为10%时，感官评分低于添加量为8%的感官评分，这是由于添加量过多，乳酸菌竞争底物发酵激烈，导致产品原有果香缺失，同时也会增加产品的成本。经过综合考量，选取8%的接种量发酵梨浆。

2.6 发酵梨浆正交试验结果

根据前期单因素的试验结果，进行正交优化。对发酵梨浆的品质有影响的发酵菌种比例、接种量、发酵温度及发酵时间4 个因素。利用SPSS 软件进行L9（34）正交试验设计。发酵结束后进行感官评分。试验结果见表8、表9

表8 优化梨浆发酵工艺正交试验结果与分析Table 8 Orthogonal test results and analysis of optimized pear juice fermentation process

续表8 优化梨浆发酵工艺正交试验结果与分析Continue table 8 Orthogonal test results and analysis of optimized pear juice fermentation process

表9 发酵梨浆正交试验结果方差分析Table 9 Analysis of variance of orthogonal test results of fermented pear juice

由表8 可知，在影响发酵梨浆品质的4 种因素中，发酵温度为最主要因素，接下来依次为：菌种比例，接种量及发酵时间。在每个因素中均为2 水平较好，即植物乳杆菌299∶保加利亚乳杆菌717∶嗜热链球菌176=4∶1∶1（体积比），发酵温度 37 ℃，接种量 8%，发酵时间 84 h。由表9可知，A'、B'、C'3 个因素各水平之间差异显著，而D'因素3 水平之间差异不显著。考虑在减少发酵时间及成本的同时，感官评价差异较小。因此，选择发酵时间为72 h。最终确定发酵工艺最佳组合为：A'2B'2C'2D'1。经验证，在最佳工艺组合的条件下，发酵梨浆的感官评分为93 分，高于A'2B'2C'2D'2组合。因此，发酵梨浆最佳工艺为：植物乳杆菌299∶保加利亚乳杆菌717∶嗜热链球菌 176=4∶1∶1（体积比），发酵温度 37 ℃，接种量8%，发酵时间72 h。

2.7 发酵前后梨浆中有机酸含量变化

有机酸的种类及含量与果蔬风味有着密切联系。在水果中，含量较为丰富的只有一两种有机酸，其余有机酸为少量存在[14]。梨果品种不同有机酸组成及含量差异也较大[15-16]。经微生物发酵，梨浆中有机酸发生改变，结果如表10 所示。

表10 有机酸分析结果Table 10 Organic acids contents of sample

由表可知，在发酵前，梨浆的酸味主要是由苹果酸和柠檬酸共同作用产生的，而在发酵后，呈酸物质发生改变。在发酵前，梨浆中苹果酸，柠檬酸含量丰富，在3 种复合乳酸菌的发酵下，梨浆中有机酸含量发生变化。草酸、苹果酸及柠檬酸含量下降，其中苹果酸含量下降最多，由36.49 mg/100 g 下降至3.10 mg/100 g，草酸和柠檬酸基本不变。乳酸含量显著增多，由1.65 mg/100 g上升为116.27 mg/100 g。出现这样的这样结果的原因有：1）乳酸菌利用梨浆中的糖类进行发酵，产生乳酸，使得发酵后乳酸含量上升。2）苹果酸-乳酸（MLF）生化反应，使得苹果酸转化为乳酸[17-18]。3）伴随MLF 过程，柠檬酸也能被乳酸菌分解，产生具有香气的物质[19-20]。

3 结论

本研究对实验室自主分离的植物乳杆菌发酵剂的制备工艺进行了优化，并复配保加利亚乳杆菌717和嗜热链球菌176 对梨浆进行发酵，并优化工艺，得到一款发酵梨浆饮料。

植物乳杆菌发酵剂制备工艺中保护剂配比为：谷氨酸钠2%、海藻糖5%、乳糖5%，脱脂乳10%，保护剂添加量与菌泥为3∶1（mL/g），在上述条件下，得到菌粉发酵剂菌活为8.48×109cfu/g。最优发酵梨浆工艺为：植物乳杆菌299∶保加利亚乳杆菌717∶嗜热链球菌176=4∶1∶1（体积比），接种量为8%，发酵温度为 37 ℃，发酵时间72 h。此条件下梨浆得到充分发酵，口感突出，风味酸甜。发酵前后有机酸含量发生变化，发酵前梨浆中含量较为丰富的有机酸为：柠檬酸、苹果酸、乳酸、草酸。其中苹果酸、柠檬酸有优势有机酸，含量分别为：36.49、38.59 mg/100 g。经 3 种复合乳酸菌发酵后，梨浆中有机酸含量发生变化，有机酸含量依次为：乳酸、柠檬酸、苹果酸、草酸。其中乳酸含量由1.65 mg/100 g 升高为 116.27 mg/100 g。