汽爆辅助酶解制备鱼皮ACE抑制肽工艺优化

涂丹，张益奇，2，，张燕平，戴志远，2

（1.浙江工商大学海洋食品研究院，浙江 杭州 310035；2.浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室，浙江 杭州 310035）

罗非鱼是我国淡水鱼养殖的主要品种之一，2017年产量达158.46 万吨[1]。目前罗非鱼的加工主要以冷冻鱼片为主，导致大量鱼皮、鱼鳞等下脚料亟待处理[2]。近年来，国内外对鱼类胶原蛋白的研究热度逐年增加，主要集中在鱼皮源胶原蛋白[3]、明胶[4]、生物活性肽的提取[5-6]、鱼皮营养成分的分析[7]以及鱼皮酶解产物功能特性等方面[8-10]。

胶原蛋白三股螺旋区域富含潜在的血管紧张素转换酶（angiotension converting enzyme，ACE）抑制活性肽段，但难以被基质金属蛋白酶之外的商品蛋白酶酶解[11]。为了暴露酶切位点，提高酶解效率，促进ACE 抑制肽的释放，通常需要在酶解前对胶原蛋白进行预处理。胶原ACE 抑制肽制备通常直接以明胶为原料[12]、采用长时间热处理[13]或使用大剂量酸、碱、酶制剂等[14]，但这些处理过程繁琐、耗时长，甚至还会造成严重的环境污染。汽爆处理是近年来发展迅速的一种绿色、高效的新型物理预处理方法，该技术基于短时间高温高压蒸煮，使高压蒸气进入原料内部空隙，然后在极短的时间内爆破释放，热能瞬间转化为机械能从而破坏蛋白高级结构[15]。前期研究发现汽爆处理能够显著提高鱼皮蛋白质的溶出率和酶解效率。汽爆处理通过改变鱼皮蛋白的结构进而影响其酶解进程，因而也就可能会改变蛋白酶酶解最优条件。

目前用于治疗高血压的药物主要通过化学合成，如卡托普利、依那普利等，这些化学合成药物降血压效果虽显著，但需要长期服用且会引起咳嗽、丧失味觉、肾功能下降等一系列副作用[16]。酶解天然蛋白资源制得的ACE 抑制肽具有安全性高、易吸收、毒副作用小且可长期使用而备受关注[17]。本文以罗非鱼鱼皮为原料，以酶解液ACE 抑制率和水解度为指标，通过单因素试验研究汽爆处理条件和酶解条件对罗非鱼鱼皮酶解效率的影响，进一步通过响应面法确定了汽爆辅助酶法制备鱼皮降血压肽的制备工艺，以期为鱼皮生物活性肽的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

罗非鱼皮：湛江环球水产有限公司；碱性蛋白酶（alcalase 3.0T，标称活力为3.0 AU/g）：诺维信（中国）生物技术有限公司；邻苯二甲醛（o-Phthalaldehyde，OPA）；十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）；二硫苏糖醇（DL-Dithiothreitol，DTT）、马尿酸（hippuric acid，HA）、马尿酰-组氨酰-亮氨酸（N-hippuryl-His-Leu tetrahydrate，HHL）、血管紧张素转换酶（A6778-.1UN）、抑肽酶、细胞色素C、碳酸酐酶、杆菌肽等：美国Sigma 公司；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）：美国 Tedia公司。

1.2 仪器与设备

400Y 多功能粉碎机：永康市铂欧五金制品有限公司；QBS 200B 汽爆机：正道生物能源公司；DGG-9123A 电热恒温鼓风干燥箱：上海森信实验仪器有限公司；DSHZ-300A 旋转式恒温振荡器：太仓市实验设备厂；Fresco 21 冷冻高速离心机、EVOLUTION 60S 紫外分光光度计：美国Thermo Fisher 公司；QL-8bb-253旋涡振荡器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；e2695 高效液相色谱：美国 Waters 公司；K-360 凯氏定氮仪、K-425 快速消解仪：瑞士BUCHI 公司；MLS-3781L 高压灭菌锅：日本Panasonic 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 汽爆罗非鱼皮粉的制备

新鲜鱼皮，剪成约5 cm×5 cm 大小，控制料液比0.1 g/mL，于 0.4%NaOH 溶液浸泡 2 h（4 ℃）脱去表面脂肪，流水冲洗3 h，经不同汽爆压力处理一定时间，烘干，粉碎后冷藏备用。

1.3.2 罗非鱼皮酶解处理

准确称取一定量的罗非鱼皮于酶反应器中→调节底物质量浓度至0.02 g/mL，55 ℃预热10 min→碱性蛋白酶酶解→沸水浴灭酶10 min→8 000 r/min 离心10 min→上清液即为罗非鱼皮酶解液。

1.3.3 酶解单因素试验

以酶底比、酶解时间、pH 值和酶解温度作为考察因素，以酶解液水解度和ACE 抑制率作为考察指标进行单因素试验设计，每组试验重复3 次。

1.3.3.1 酶底比（E/S）对罗非鱼皮酶解效果的影响

在酶解温度50 ℃、pH 8.0、酶解时间2 h 条件下，设定不同的酶底比为：0.1 %、0.2 %、0.5 %、1.0 %和2.0%。

1.3.3.2 酶解时间对罗非鱼皮酶解效果的影响

在酶解温度 50 ℃、pH 8.0、酶底比（E/S）0.5%条件下，设定不同的酶解时间：30、60、90、120、180 min。

1.3.3.3 酶解pH 值对罗非鱼皮酶解效果的影响

在酶解温度50 ℃、酶底比0.1%、酶解时间2 h 条件下，设定不同的 pH 值：7.5、8.0、8.5、9.0 和 9.5。

1.3.3.4 酶解温度对罗非鱼皮酶解效果的影响

在pH 8.0、酶底比0.1%、酶解时间2 h 条件下，设定不同的酶解温度：45、50、55、60 和 65 ℃。

1.3.4 响应面试验设计

在单因素试验基础上，依据Design-Expert 8.0.6.1软件中的Box-Behnken Design 设计原理，选取酶解温度（A）、pH 值（B）和酶底比（C）为 3 个考察因素，ACE抑制率（Y）为响应值，进行三因素三水平的试验设计，以确定罗非鱼皮最佳酶解工艺条件。试验因素及水平设计见表1。

表1 响应面试验设计因素水平表Table 1 Factors of response surface test design

1.3.5 水解度的测定

采用OPA 法，根据Nielsen 等[18]方法适当修改。配制OPA 试剂（现用现配）：将7.620 g 四硼酸钠和200 mg SDS 用150 mL 去离子水溶解，待完全溶解后加入4 mL溶有160 mg OPA 的乙醇溶液，混匀后再加入176 mg DTT，定容至 200 mL。

取400 μL 罗非鱼皮酶解液，加入到装有3 mL OPA 的试管中，混匀后静置2 min，测定其在340 nm波长下的吸光度值。以纯水作为空白组，100 mg/L 丝氨酸溶液代替样品作标准曲线，根据标准曲线计算鱼皮酶解液中游离氨基含量，并按照公式计算水解度（hydrolysis degree，HD）：

1.3.6 ACE 抑制率的测定

参照Wu 等[19]的方法并略作修改。用0.1 moL/L 硼酸缓冲液（pH 值 8.3，含有 0.3 moL/L NaCl）配制反应底物N-马脲酰组氨酰亮氨酸（N-hippuryl-histidylleucine，HHL，6.5 mmoL/L）和 ACE（100 U/L）。取适量鱼皮酶解液稀释至40 μL，与25 μL ACE 溶液混合并于振荡器中混匀，37 ℃水浴保温10 min，然后加入40 μL HHL 溶液启动反应，37 ℃水浴继续保温 30 min，最后加入85 μL 1 moL/LHCl 溶液终止反应。反应溶液经0.45 μm 滤膜过滤后，用于高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC） 分析测定反应中产生的HA 的量。

色谱条件：Waters e2695 HPLC 系统和 UV/Vis 检测器，SunFire C18 色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）。上样量10 μL，检测波长228 nm，流动相为乙腈-0.1%三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）水溶液（30∶70，体积比），流速为0.8 mL/min。按照公式计算ACE 抑制率：

式中：A 为用纯水代替酶解物参与反应条件下所产生的HA 的量；B 为酶解物参与反应的条件下所产生的HA 的量。

1.3.7 酶解液相对分子质量分布的测定

参照黄丹丹等[20]的方法并略作修改。取适量鱼皮酶解液，经0.45 μm 滤膜过滤后上样分析。色谱条件为：采用Waters2695 HPLC 系统和UV/Vis 检测器，TSKgel G2000-SWxl（7.8 mm×300 mm，Tosoh）色谱柱，检测波长220 nm，洗脱液为45%乙腈-55%水溶液（0.1%TFA），流速 0.5 mL/min，进样量 10 μL。相对分子质量校正曲线所用标准品为：马尿酰-组氨酰-亮氨酸（429 Da）、杆菌肽（1 422 Da）、抑肽酶（6.5 kDa）、细胞色素 C（12.4 kDa）、碳酸酐酶（29 kDa）。

1.4 数据处理

试验数据以平均数±标准差表示。采用SPSS17.0统计软件进行方差分析（ANOVA），用Duncan 多重比较法进行显著性检验（p<0.05）；应用Sigmaplot 12.5 进行数据整理、作图，并用Design Expert 8 软件进行响应面试验设计与分析。

2 结果与分析

2.1 汽爆处理对罗非鱼皮酶解效果的影响

酶解条件：酶底比0.1%、酶解时间2 h、pH 8.0 和酶解温度50 ℃。在相同酶解条件下，以不汽爆处理为对照组，考察汽爆处理对鱼皮酶解产物ACE 抑制率和水解度的影响，如图1 所示。

图1 汽爆压力和保压时间对鱼皮酶解产物ACE 抑制率和水解度的影响Fig.1 Effect of steam explosion treatment on ACE inhibition rate and hydrolysis degree of fish skin hydrolysate

由图1A 可知，与对照组相比，汽爆处理后鱼皮酶解液的ACE 抑制率和水解度都显著增大（p＜0.05），而不同汽爆压力间鱼皮酶解液ACE 抑制率无明显差异（p＞0.05）。综合考虑汽爆样品的均一性及水解度情况，选择0.6 MPa 作为汽爆处理压力。

由图1B 可知，随着保压时间的延长，水解度不断升高（p＜0.05），而ACE 抑制率呈先升高后降低趋势，当保压时间为0.5 min 时达到最高（79.88%），比未处理组提高了27.14%，此时水解度比未处理组提高了1.8 倍。这可能是因为汽爆过程中，高温高压处理以及饱和水蒸汽瞬间泄压产生的机械剪切力破坏了鱼皮胶原蛋白高级结构，使得富含潜在ACE 抑制活性肽段的疏水区域暴露，有利于蛋白酶水解及ACE 抑制肽段的释放。然而，过长的保压时间可能会使已经生成的降血压活性肽重新聚集或过度水解，从而导致ACE 抑制率下降[21-22]。因此，选择汽爆压力0.6 MPa，保压时间0.5 min 进行后续的酶解参数优化。

2.2 酶解参数的选择

酶底比、酶解时间、pH 值和酶解温度对罗非鱼皮酶解液ACE 抑制率和水解度的影响如图2 所示。

图2 酶底比、酶解时间、pH 值和酶解温度对酶解产物ACE 抑制率和水解度的影响Fig.2 Effect of different enzymatic hydrolysis conditions on ACE inhibition rate and hydrolysis degree of enzymatic hydrolysate

由图2A 可知，随着加酶量的增大，水解度不断升高（p＜0.05），而ACE 抑制率呈先升高再降低的趋势，在酶底比为1%时ACE 抑制率达到最大值（92.25%）。黄嘉成等[23]用沙丁鱼制备降血压活性肽时也发现水解度过高反而使ACE 抑制率降低，可能是因为加酶量越大，水解度越大，同时释放的ACE 抑制肽越多；然而加酶量过多时，酶分子与底物结合达到饱和状态，对酶解液ACE 抑制活性影响减弱[24]。故选用1%作为最适酶底比。

由图2B 可知，罗非鱼皮酶解液ACE 抑制率随酶解时间延长不断升高（p＜0.05），120 min 时达到最高值（86.23%），进一步延长酶解时间，酶解液ACE 抑制率变化不明显（p＞0.05），水解度则随着酶解时间延长不断上升。酶解时间过长，一些释放的活性肽段可能在蛋白酶作用下进一步水解。故选用120 min 作为罗非鱼皮的最佳酶解时间。

由图2C 可知，随着酶解体系pH 值增大，罗非鱼皮酶解液ACE 抑制率和水解度都逐渐增加，且均在pH 8.5 时达到最高值，继续增大pH 值，ACE 抑制率和水解度均呈直线下降。在不同pH 值条件下，蛋白质的解离状态不同，与蛋白酶的接触位点也不同，进而使得鱼皮酶解产物不同[24-25]。故选用8.5 作为最适pH 值。

由图2D 可知，酶解产物ACE 抑制率和水解度随酶解温度的升高也呈先上升后降低的趋势，且均在酶解温度55℃时达到最高值。这可能是因为每种蛋白酶都有其最适温度范围，超过最适温度后，酶开始变性，使得酶解效率降低[26]。综合以上单因素试验结果，确定汽爆辅助酶解法制备鱼皮降血压肽的较佳工艺参数为：汽爆压力0.6 MPa、保压时间1 min、酶底比1%、酶解时间 2 h、酶解 pH 值 8.5、酶解温度 55 ℃、pH 8.5。

2.3 响应面试验

2.3.1 二次响应面回归模型的建立与分析

在单因素试验结果的基础上，固定底物浓度为2 %、酶解时间为 2 h，选取酶解温度（A）、pH 值（B）和酶底比（C）3 个因素为自变量，以酶解产物ACE 抑制率（Y）为目标函数，根据Box-Behnken 中心组合试验设计原理进行响应面设计，试验设计方案和结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of the response surface experiments

续表2 响应面试验设计及结果Continue table 2 Design and results of the response surface experiments

对表2 进行回归分析得到相应的二次响应面回归方程：Y=94.53+2.47A-2.19B-1.34C-0.82AB-0.012AC-0.88BC-9.76A2-7.00B2-3.94C2。

显著性方差分析的结果如表3 所示。

表3 回归模型及方差分析结果Table 3 Regression model and analysis of variance

由表3可知，模型 p＜0.000 1，回归模型极显著（p＜0.01）；模型的一次项 A、B、C，二次项 A2，B2，C2，以及交互项 BC 对 ACE 抑制率影响极其显著（p＜0.01），二次项 AB 对 ACE 抑制率影响显著（p＜0.05），说明各因素对ACE 抑制率的影响存在一定的交互作用，并不是简单的线性关系；失拟项p 值不显著，表明模型拟合程度良好；根据F 值大小得出各因素对ACE 抑制率的影响顺序为温度＞pH 值＞酶底比；相关系数R2=0.998 0，模型的校正系数R2Adj=0.995 4，变异系数CV=0.58%，说明不确定因素对试验结果的干扰较小，ACE 抑制率的变化有99.80%来源于所选变量，可以用此模型分析和预测汽爆辅助酶解制备鱼皮ACE 抑制肽的情况。

根据回归方程作响应面图，考察所拟合的响应面形状，分析处理因素对鱼皮ACE 酶解液抑制活性的影响见图3。

图3 各因子交互作用对酶解物ACE 抑制率的响应曲面图Fig.3 Response surface analysis of the influence on ACE-inhibitory by each factors

响应面图可以反映各因素与响应值之间的关系，以及各因素间交互作用的显著性，响应面图坡度陡峭或平缓，反映响应值对于试验因素的改变是否敏感。由图3 可知，各因素中，酶解温度对于鱼皮酶解液ACE 抑制活性影响最为显著，响应面坡度陡峭，随着酶解温度的升高，ACE 抑制活性呈先增大后减小趋势；其次，酶底比响应面坡度相比pH 值稍平缓，pH 值比酶底比的影响相对显著。这与方差分析结果一致，即各因素对ACE 抑制率的影响顺序为酶解温度＞pH值＞酶底比。

2.3.2 最佳工艺条件的确定

由Design-Expert 分析得最佳酶解条件为：酶解温度55.66 ℃，pH 值8.42，酶底比0.92%。此条件下ACE抑制率理论值为94.97%。为方便验证，将参数修正为酶解温度56 ℃，pH 值8.4，酶底比0.92%，底物浓度2%，酶解时间2 h，进行3 次平行试验，得到ACE 抑制率实际值为93.16%，说明模型与实际情况拟合较好，能够较好的预测出实际ACE 抑制率。

2.4 罗非鱼皮酶解液相对分子质量分布

在试验所得的最优酶解条件下，采用碱性蛋白酶对汽爆处理前后鱼皮进行酶解，酶解产物的相对分子质量分布曲线如图4 所示。

图4 鱼皮酶解产物相对分子质量分布图Fig.4 Gel filtration chromatograms of fish skin hydrolysate treated with alcalase under optimal conditions

由图4 可知，未处理鱼皮酶解后仍存在大量大分子蛋白质，其中4 000 Da 以上约占45.66%。汽爆鱼皮酶解产物主要分布于307 Da～3 323 Da，其中2 000 Da～4 000 Da、1 000 Da～2 000 Da 和 300 Da～1 000 Da 分别占25.34%、21.64%和51.36%，不存在5 000 Da 以上的较大分子。这说明汽爆处理可显著改善鱼皮蛋白的酶解效果，使其降解成小分子肽段。

3 讨论

化学合成降压药物对高血压疗效较好，但会引起咳嗽、丧失味觉、肾功能可逆性下降等副作用，天然蛋白源的ACE 抑制肽因其安全性高，易吸收等优势被广泛关注[27]。前人研究发现多肽C 端含有脯氨酸（Pro）或羟脯氨酸（Hyp）时具有较高的 ACE 抑制活性[20，28]。胶原蛋白三股螺旋区域呈（Gly-X-Y）n 周期性排列（其中X、Y 一般分别为Pro 和Hyp），因此胶原蛋白可能富含潜在的ACE 抑制活性肽段。但胶原蛋白三螺旋结构通过分子内及分子间氢键、范德华力、共价交联等作用力相连接，难以被除基质金属蛋白酶之外的商品蛋白酶酶解[11]。现有的胶原ACE 抑制肽制备工艺通常直接以提取的胶原、明胶为原料[12]、采用长时间热处理[13]或使用大剂量酸、碱、酶制剂等[14]，这些处理过程繁琐、耗时长，甚至还会造成严重的环境污染。因此急需寻找适于产业化的快速、简便的胶原蛋白预处理方法，破坏其致密的三螺旋区域，提高酶解和ACE 抑制肽释放效率。

通过适当、适度的热处理破坏蛋白质分子的高级结构，使原料蛋白形成利于提取或控制酶解的亚基解离或聚集状态，在此基础上采用商品蛋白酶进行限制性酶解，是蛋白质物理改性研究中的热点[29-30]。如Yang等[13]研究了高温条件下军曹鱼皮明胶水解液的抗氧化特性；涂丹等[29]发现采用121 ℃预处理鱼鳞蛋白，可显著降低碱性蛋白酶的添加量和酶解时间；Min 等[31]发现水热处理（150 ℃～250 ℃）可完全替代酸、碱、酶水解处理，用于猪皮蛋白水解液的制备。本研究采用汽爆处理罗非鱼皮，高温、高湿环境使得胶原蛋白分子间疏水键、氢键和某些共价键断裂，使其三股螺旋结构变得松散，从而暴露出更多酶切位点，提高酶解效率。汽爆处理会改变鱼皮蛋白结构进而影响其酶解进程，因而也就可能会改变鱼皮蛋白酶解条件，为了提高鱼皮多肽的得率，有必要对其酶解条件进行优化。

除原料预处理技术外，蛋白质酶解效果也与酶解温度、酶添加量及水解时间等工艺参数密切相关。李敏雄等[32]采用碱性蛋白酶酶解罗非鱼皮制备胶原蛋白肽，酶解最佳工艺条件为：时间7 h、加酶量7%、温度60 ℃、pH 值10.38，此条件下罗非鱼皮水解度可达23%，酶解液分子量集中在180 Da～1 000 Da。孔惠等[33]先后采用0.2%稀硫酸与1.0%柠檬酸复合处理，并结合水提法提取鲑鱼皮明胶，进一步选用木瓜蛋白酶进行酶解处理，加酶量7%，pH 值8.0，水解时间2.5 h，此工艺条件下水解度为12.65%。本研究通过单因素及响应面试验优化出罗非鱼皮最佳酶解条件为：汽爆压力0.6 MPa、保压时间0.5 min、酶底比0.92 %、酶解时间2 h、pH 值8.4、酶解温度56 ℃。与前人研究相比，本研究通过将鱼皮明胶提取与酶解工艺有机结合，简化了工艺路线，酶添加量更少，处理效率更高。

4 结论

本研究运用响应面优化汽爆辅助酶法制备鱼皮蛋白ACE 抑制肽的工艺参数，并进一步分析了酶解产物的相对分子质量分布情况。结果表明，最优的工艺参数为汽爆压力0.6 MPa、保压时间0.5 min、酶底比0.92%、酶解时间 2 h、pH 值 8.4、酶解温度 56 ℃。在此条件下酶解产物ACE 抑制率理论值为94.97%，实际值为93.16 %，其相对分子质量主要分布于307 Da～3 323 Da。本研究结果可为汽爆辅助鱼皮酶解制备ACE 抑制肽的实际生产提供依据与参考，但本试验只是初步研究了鱼皮ACE 抑制肽粗提物的制备工艺，如何通过现代分离纯化技术提高其纯度和抑制活性有待进一步研究；此外，对于鱼皮经汽爆处理后结构变化机制尚有待深入研究。