酶法制备乳源钙螯合肽及其特性表征

刘晓容，郭俊斌，廖婉雯，陈惠，陈泳怡，黄钜才，林榕欣，刘飞，方祥，曹庸，苗建银，

（1.华南农业大学食品学院，广东 广州 510642；2.广东省功能食品活性物重点实验室，广东 广州 510642；3.广州绿萃生物科技有限公司，广东 广州 510665）

钙是人体必需的一种矿物质，其总重量占人体重的1%～2%，钙可以调节心脏搏动，维持肌肉的收缩和神经冲动的传递，细胞分泌和凝血等生理过程，对人体的酸碱平衡、新陈代谢有很重要的作用。缺钙会引发人体出现疾病，因此补钙是必要的。人体的小肠上段呈酸性，钙离子不易发生沉淀反应。而小肠下段pH值呈中性至碱性，钙离子易与植酸、草酸和磷酸等结合生成不可溶的钙盐沉淀，又因钙在小肠内呈离子状态才能被吸收[1]，从而造成人体对钙的吸收率降低[2]。如何提高钙在小肠内的整体溶解度，从而提高人体对钙的吸收率，目前已成为钙在人体被高效利用的重要研究方向。

近年来对钙离子结合肽的研究越来越多，如利用牛骨、羊骨、猪骨、鱼骨等[3-7]进行酶解制备钙螯合肽。酪蛋白又名干酪素，是一类典型的磷蛋白，经胰蛋白酶水解可制得大量的生物活性肽。其中的酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides，CPPs）含有丰富的磷酸丝氨酸和谷氨酸[8-10]，在pH 值呈中性至弱碱性的人体小肠下段中，可与钙离子螯合生成可溶性的钙肽螯合物，提高整段小肠内的可溶性钙的平均含量，从而提高人体对钙的吸收率[11]。美国、日本已将其作为补钙功能食品的原料，德国也将其列入药典，而我国的研究还处于初级阶段[12]。

本试验通过对乳源酪蛋白进行酶解制备和优化，以期得到高活性钙肽螯合物的最优酶解条件，并确定此条件下所得活性肽的分子量分布，对最优酶解产物及其螯合物进行了氨基酸分析、紫外-可见光谱和红外光谱分析。本研究结果具有重要的应用价值和潜在的商业价值，可以为后续钙补充剂的研究和应用奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

酪蛋白、胰蛋白酶（酶活为10 000 U/g）：广州绿萃生物科技有限公司；无水氯化钙：天津宏达化学试剂厂；邻甲酚酞络合剂：山东西亚化学工业有限公司；8-羟基喹啉、乙醇胺：天津大茂化学试剂厂；其余试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

HQ45 恒温摇床：中国科学院武汉科学仪器厂；pH计：赛多利斯科学仪器（京）有限公司；DF-101S 数显恒温水浴锅：巩义予华仪器有限公司；L530 台式低速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；AL104 电子天平：上海梅特勒-托利多仪器有限公司；EnVision 酶标仪：玻金埃尔默仪器有限公司；LC-8 分析型高效液相色谱仪：日本岛津公司；SYKAM S-433D 氨基酸分析仪：德国赛卡姆公司；UV-240IPC 型紫外分光光度计：日本岛津公司；Nicolet 6700 傅里叶变换红外光谱仪：美国Thermo Fisher Scientific 公司。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白酶解液制备的工艺流程

溶解酪蛋白→调节pH 值和温度→加入胰蛋白酶→恒温酶解→灭酶→冷却→调pH 值至等电点4.6→离心→取上清液测活性

1.3.2 酪蛋白与钙的螯合反应处理

在10 mL 离心管中加入1 mL 5 mmol/L CaCl2和2 mL 0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.8），再加入 1 mL酶解液样品，置于水浴摇床中37 ℃反应1 h 后，离心20 min（4 000 r/min），取上清液用于活性的测定。

1.3.3 钙螯合活性的测定

采用邻甲酚酞比色法[13]测定钙螯合性。

1.3.3.1 标准曲线的制作

分别取标准钙工作液（50 μg/mL）0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 于 10 mL 试管中，分别加一级蒸馏水补足1 mL，再各加工作显色液5 mL 摇匀，8 min 内用酶标仪于570 nm 处检测吸光值，建立标准曲线[13]。

1.3.3.2 活性的测定

取1 mL 稀释8 倍的样品于10 mL 离心管中，再加入5 mL 工作显色液。置于涡旋机上摇匀20 s，在8 min内用酶标仪测定在570 nm 波长下的吸光值。将测得的样品吸光值代入所得的标准曲线公式y = 0.012 9x +0.824 5（横坐标为钙含量/μg，纵坐标为吸光值，相关系数 r=0.967）。

钙螯合量（μg/mL）=（X×n）/V

式中：X 为测得的样品吸光值代入标准曲线所得的稀释后的钙含量，μg；n 为稀释倍数；V 为样品的体积，mL。

1.3.4 酪蛋白酶解工艺单因素试验

根据预备试验，本试验酶解酪蛋白的单因素的基本条件定为：底物浓度6%（底物固液比g/mL）、酶用量0.6 %（酶与酪蛋白质量分数）、酶解pH 8.0 、温度50 ℃。改变其中一个因素，保持其他因素不变，测定其钙螯合活性。各因素水平梯度为：底物浓度4%、6%、8%、10%；加酶量0.4%、0.6%、0.8%、1.0%；pH 7.5、8.0、8.5、9.0；酶解温度 40、45、50、55 ℃；酶解时间 1、2、3、4、5、6 h。

1.3.5 正交试验

根据单因素试验结果，将酶解时间固定为3 h，采用四因素三水平的正交试验设计，以钙螯合量为指标，着重研究底物浓度、加酶量、pH 值和温度，筛选出最优水平组合。

1.3.6 最优酶解条件下钙螯合肽的制备

取适量酪蛋白将其配成7%的底物浓度，用1 mol/mL NaOH 调节pH 值至8.7，加酶量0.8%，将酶解液于温度53 ℃水浴摇床3 h 后，95 ℃水浴灭酶10 min，恢复到室温25 ℃，用1 mol/mL HCl 调节pH 值至等电点4.6，离心 20 min（4 000 r/min），取上清液冻干。

1.3.7 最优酶解条件下钙肽螯合物的制备

称取一定量样品，将其配成5%浓度，用1 mol/mL NaOH 调节pH 值 至7.0，按钙螯合肽∶钙（质量比）=2∶1 的比例加入无水氯化钙，于50 ℃螯合反应1 h，取出冷却至室温25 ℃，加入5 倍体积的无水乙醇，4 000 r/min 离心10 min，取出沉淀，再用少量无水乙醇于4 000 r/min 离心10 min 洗涤沉淀，将沉淀烘干制得钙肽螯合物备用[14]。

1.3.8 最优酶解条件钙螯合肽的分子量测定

采用高效液相色谱法测定最优酶解条件下的钙螯合肽分子量，流动相为（乙腈，含0.1%三氟乙酸）∶（水，含 0.1%三氟乙酸）=20∶80（体积比），检测波长220 nm，进样量 10 μL；流速 0.5 mL/min；色谱柱 TSKgel G2000 SWXL（300 mm×7.8 mm）；柱温 25 ℃；配制0.1%（mg/mL）的肽混合标准品溶液，过膜后进样，绘制校正曲线（Y=-0.311X+8.729 6，R2=0.997 2）；样品从定容50 mL 的酶解液中取0.5 mL 溶解于10 mL 水中，配置成1.6 mg/mL 的样品。

1.3.9 最优酶解条件下钙螯合肽和钙肽螯合物的氨基酸分析测定

样品的前处理参照GB 5009.124-2016《食品安全国家标准食品种氨基酸的测定》方法，准确称取CPPs、CPPs-Ca 各 15 mg 于消化管中，加入 10 mL（6 mol/L）盐酸并充入氮气，于120 ℃烘箱中水解24 h，用氨基酸自动分析仪测进行氨基酸分析。

1.3.10 最优酶解条件下钙螯合肽和钙肽螯合物的紫外光谱测定

将最优酶解条件下钙螯合肽和钙肽螯合物配制成1.0 mg/mL 的水溶液，在200 nm～600 nm 下进行紫外扫描。

1.3.11 最优酶解条件下钙螯合肽和钙肽螯合物的红外光谱测定

分别将最优酶解条件下钙螯合肽和钙肽螯合物粉末，50 ℃下烘至恒重，各取1 mg 晶体研磨后，加压压片，维持5 min 左右，卸压得透明样品片，用傅里叶红外光谱仪在500 cm-1～4 000 cm-1区间内扫描。

1.3.12 数据处理

2 结果与分析

2.1 不同底物浓度对钙螯合活性的影响

底物浓度对钙螯合活性的影响见图1。

图1 底物浓度对钙螯合活性的影响Fig.1 Effect of substrate concentration on chelating activity

如图1 所示，在底物浓度4%～8%范围内，随着底物浓度的增加，钙螯合活性也随之上升。当底物浓度为8%时，其钙螯合活性达到最大，为31 μg/mL。当底物浓度在8%～10%范围内，其钙螯合活性呈下降趋势。这说明当底物浓度为8%～10%时，酪蛋白-胰蛋白酶体系存在着底物抑制的现象。有研究认为牛乳蛋白中存在着丝氨酸蛋白酶抑制剂，通过与蛋白酶结合的过程，消耗掉部分酶，由于该种抑制剂与底物浓度的含量关系为正比，所以使得底物失去了与酶结合的机会[15]。酶解反应与底物浓度存在着密切的关系[16]。当底物处于较高浓度时，酶全被底物包裹着，反应体系的有效水分变少，阻碍了两者的扩散，从而抑制了酶解反应的进行；当底物处于较低浓度时，底物与酶的有效距离增大，两者的接触面积减少，使底物的酶解受到抑制。因此，酶促反应都有其最适的底物浓度，本试验确定的最优底物浓度为8%。

2.2 不同加酶量对钙螯合活性的影响

加酶量对钙螯合活性的影响见图2。

图2 加酶量对钙螯合活性的影响Fig.2 Effect of enzyme dosage on chelating activity

如图2 所示，当加酶量在0.4%～0.8%范围时，钙螯合活性随着加酶量的增加而不断升高，当加酶量为0.8%时，钙螯合活性达到最高，为25 μg/mL。而加酶量大于0.8%时，钙螯合活性有下降的趋势。因为酶的专一性，底物先被分解成为小分子肽，小分子肽可以进一步分解为氨基酸，这是蛋白酶竞争结合的过程，而竞争结合作用在酶达到一定浓度后才被削弱，故增大加酶量能够提高酶解效率[17]。当加酶量超过一定值，此时的底物大部分为小分子肽，蛋白酶竞争结合作用最弱，底物被酶饱和，酶解效率不再正比于加酶量，甚至出现下降的趋势。

2.3 不同pH值对钙螯合活性的影响

不同pH 值对钙螯合活性的影响见图3。

如图3所示，当pH值在7.5～8.5范围内，随着pH值升高，钙螯合活性几乎呈直线上升，当pH 值为8.5 时，钙螯合活性最大，其值为23 μg/mL。当pH 值在8.5～9.0 时，钙螯合活性几乎呈直线下降。由于pH 值能通过影响酶活性部位的有关基团、空间结构和中间复合物的解离，进而影响酶解效率[18]。另外，在pH 值为8.5时，钙螯合活性达到最大值，这与胰蛋白酶最适pH 值相近。当高于或低于最适pH 值，胰蛋白酶的活性中心构象会发生变化，破坏其空间结构，从而使酶活性受到抑制[19]，所以最适pH 值约为8.5，酶在该范围的作用效果最好，酶与底物结合力最强。此外，酪蛋白酶解过程pH 值会逐渐降低，所以维持酶解过程pH 值的稳定，对于酶解反应效率的意义重大。

2.4 不同温度对钙螯合活性的影响

图3 pH 值对钙螯合活性的影响Fig.3 Effect of pH on chelating activity

温度对钙螯合活性的影响见图4。

图4 温度对钙螯合活性的影响Fig.4 Effect of temperature on chelating activity

由图4 可以看出，酶解液温度为40 ℃～50 ℃时，钙肽螯合量随温度升高呈递增趋势，并在50 ℃时达到最大值15 μg/mL，超过50 ℃时，钙肽螯合活性降低。温度能影响蛋白酶分子的稳定性[20]，酶分子的肽键存在着一定的空间构象，当酶解温度低于其最适温度，酶分子运动的活跃度减小，从而减少了蛋白酶与底物的接触；当酶解温度高于其最适温度，会使次级键解离，致使酶失活，最终导致酶解效果减弱[21-22]。因此，胰蛋白酶在40 ℃～50 ℃范围内能较好地发挥酶解活性，温度过高，酶活性降低，钙螯合活性也随之降低。

2.5 不同酶解时间对钙螯合活性的影响

不同酶解时间对钙螯合活性的影响见图5。

图5 酶解时间对钙螯合活性的影响Fig.5 Effect of time on chelating activity

由图5 可知，在1 h～3 h 范围内，活性肽的钙螯合活性随着酶解时间的增加而上升，在3 h 时达到最大值23 μg/mL，随后呈下降趋势。在酶解反应前期，由于底物处于较高浓度，酶活性强，酶解反应受到生成物的抑制作用较小，酶与底物能有效地结合，因此钙肽螯合量增加得较快，当酶解3 h 后，增加酶解时间，反应物浓度减小，反应位点逐渐趋于饱和；产物浓度也逐渐增加，表现出越来越强的竞争抑制作用；与此同时，酶活性也会逐渐减弱；另外，中间复合物也逐渐达到稳态[23-25]。因此，酶解时间不断延长，而底物则不断被消耗，酶活性也不断降低。所以，考虑到经济效益，最适酶解时间约为3 h。

2.6 酶解工艺正交试验结果及条件验证

2.6.1 酶解工艺参数优化正交试验结果

因素水平表见表1，正交试验设计及结果见表2。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

表2 正交试验设计及结果Table 2 Orthogonal array design with experimental results

续表2 正交试验设计及结果Continue table 2 Orthogonal array design with experimental results

由极差分析可知R（加酶量）＞R（底物浓度）＞R（pH 值）＞R（温度），所以其对钙螯合活性的影响次序大小为加酶量＞底物浓度＞pH 值＞温度，由k 值可得最优水平组合为加酶量0.8%，底物浓度7%，pH 8.7，温度 53 ℃。

2.6.2 最优组合条件验证

称取一定量底物浓度为7%的酪蛋白溶解，调pH值为8.7 和温度至53 ℃后，加入0.8%的酶，恒温酶解3 h 后经冷却，离心等一系列处理后取得上清液测得的钙螯合活性达到46.78 μg/mL，高于正交试验中任何一个优化组合。

2.7 最优酶解条件下钙螯合肽的分子量分布

最优酶解物的分子量分布见表3。

表3 最优酶解物的分子量分布Table 3 The molecular weight distribution of the optimum enzymolyte

由表3 可知，在最优酶解物中，相对分子于3 kDa以下的组分占92.11 %，相关研究表明[26]，分子量在3 kDa以下的多肽，不仅更易被人体吸收，而且含有多种生物活性，在人体内能发挥一系列的生理功能。此外，有研究表明[27-28]，活性肽的分子量越小，即肽链越短，钙螯合能力越强，可能是因为较短的肽链的空间位阻较小，较容易与钙离子发生配合反应；另一方面可能是因为较短的肽链有更多的钙结合位点暴露，从而能螯合更多的钙离子。因此，低分子肽制品越来越受到行业内相关人士的关注。

2.8 最优酶解条件下钙螯合肽和钙肽螯合物的17种氨基酸分析

最优酶解条件下钙螯合肽和钙肽螯合物的氨基酸分析见表4。

表4 最优酶解条件下钙螯合肽和钙肽螯合物的氨基酸分析Table 4 Amino acid analysis of calcium chelate peptides and peptide chelated calcium

由表4 可以看出，在最优酶解物中，谷氨酸含量最高，占16.81%，脯氨酸占9.46%，赖氨酸占7.33%，缬氨酸占6.92%，亮氨酸占6.92%，天冬氨酸占5.68%，且其必需氨基酸含量占总氨基酸含量的36.4%。螯合物中含量最高的谷氨酸，占23.3%，其必需氨基酸含量占总氨基酸含量的25.24%。当Ca2+与钙螯合肽螯合时，会改变钙螯合肽的空间结构，由于氨基酸的极性和侧链基团之间存在一定的差异，导致与金属离子的亲和力也不同，所以Ca2+会与之亲和力强的氨基酸的-NH2、-COOH 中的 N、O 形成配位键。Ca2+与氨基酸的配位，会改变氨基酸的总量，因此各种氨基酸的含量在螯合前后会有所变化[29]。有研究表明，与金属螯合活性较高的有组氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等这几种氨基酸[30-31]。通过螯合前后氨基酸组分的分析显示，谷氨酸，丝氨酸和天冬氨酸的含量增加，说明谷氨酸，丝氨酸和天冬氨酸对钙的螯合能力较强，可能是因为这三种氨基酸侧链基团上的羧基与钙离子发生更强的螯合作用，从而说明谷氨酸，丝氨酸和天冬氨酸的羧基是酶水解物与金属离子的结合位点[32]。

2.9 最优酶解条件下钙螯合肽和钙肽螯合物的紫外光谱分析

最优酶解条件下钙螯合肽和钙肽螯合物的紫外光谱分析见图6。

图6 最优酶解条件下钙螯合肽和钙肽螯合物的紫外光谱分析图Fig.6 The UV spectra of calcium chelating peptides and peptides chelated calcium

紫外吸收光谱是基于物质的生色基团和助色基团的特性对紫外光谱的吸收，可用于物质的鉴定和结构分析。由图6 可知，钙螯合肽在230、272 nm 处的吸收峰在螯合钙后蓝移至222、274 nm，钙螯合肽的主要成分为肽类和氨基酸，两者的羰基在270 nm～300 nm范围内有吸收峰[33]，钙肽螯合物在270 nm～300 nm 处的吸光度相比于钙螯合肽的明显下降，可能是因为钙离子与羰基发生了螯合反应，阻碍了羰基n→π*的电子跃迁，导致两者能级之差增大，跃迁能量增加，吸收谱带向短波方向移动，发生蓝移，吸光度减弱。另外因为蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环存在着共轭双键，故紫外光能被蛋白质吸收，实验表明，最大吸收峰在280 nm 附近[34]。因此，酪蛋白酶解产物在272 nm 处有吸收峰。

2.10 最优酶解条件下钙螯合肽和钙肽螯合物的红外光谱分析

最优酶解条件下的钙螯合肽和钙肽螯合物的红外光谱分析见图7。

如图7 所示，钙螯合肽在3 080 cm-1处有一个较宽的伸缩振动峰，为羟基的特征吸收峰，在酰胺C=O处伸缩振动的特征吸收峰1 730 cm-1附近有吸收峰，同时在羟基的面外弯曲振动的特征吸收峰955 cm-1处也有吸收峰，说明钙螯合肽含有-COOH 结构。钙肽螯合物的吸收峰相对于酶解产物发生明显位移，峰形变窄，说明-COOH 结构已发生变化，-COOH 失去氢变成-COO-与钙离子结合，这与阚文翰的结果相似[29]。此外钙螯合肽在3 300 cm-1出现酰胺A 带N-H 的伸缩振动吸收峰，在1 241 cm-1处有酰胺Ⅲ带的N-H 变形峰，在1 125 cm-1处出现了C-N 的伸缩振动吸收，说明体系中有游离-NH2，这与林谢凤的结果相似[35]。

图7 最优酶解条件下的钙螯合肽和钙肽螯合物的红外光谱分析图Fig.7 Infrared spectrum analysis of peptides and peptides chelated calcium

当氨基酸与金属离子形成螯合物，金属原子共用氮的电子对，增强了C-N 键的偶极性，在1 450 cm-1～1 000 cm-1出现较强的吸收峰[34]，比较钙螯合肽和钙肽螯合物的红外光谱，可看出钙肽螯合物的主要吸收峰相比于钙螯合肽出现了位移，相对强度也发生了变化，这说明氨基酸的某些基团参与反应，受到激发，改变了振动频率，说明钙螯合肽与钙离子发生了螯合作用。因为在最优酶解产物和钙肽螯合物中，主要存在着氨基酸残基之间的酰胺键和其末端或侧链的氨基和羧基，故所呈现的红外光谱图不同，在红外光谱中会有-COOH、-NH2的伸缩振动和变角振动等吸收峰[3]。

3 结论

本试验研究通过单因素和正交试验，优化得到酶法制备乳源钙螯合肽最佳工艺参数，在此条件下所得酶解物螯合活性为46.78 μg/mL，分子量90%以上为3 kDa 以下的肽类；通过对比螯合钙前后氨基酸组成变化，可知谷氨酸，丝氨酸和天冬氨酸对钙螯合活性的贡献较大；钙螯合肽及其钙肽螯合物的紫外光谱和傅里叶变换红外光谱结果表明，两者的化学结构在螯合前后发生了变化，其中磷酸基团参与了钙螯合，其主要结合位点是-NH2、-COOH。