高龄女性冻融胚胎移植中单个或双卵裂期胚胎与单个囊胚的活产率比较及相关影响因素

从艳艳，沈 曦，匡延平

（上海交通大学医学院附属第九人民医院辅助生殖科，上海 200011）

随着“全面二胎”政策的开放，寻求辅助生殖技术帮助的高龄女性人数也随之增加。但高龄患者普遍具有获卵率低、胚胎质量差、种植率低、流产率高且同时活产率低的特点[1]。关于这类患者应该如何治疗，引起了临床医师的广泛关注。

体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET）的最终目的为获得健康的活产婴儿。但双胎妊娠会增加围产期并发症的发病率，如早产率增加、新生儿出生体重低、产后出血发生率高及妊娠期高血压疾病的发病率高[2]，尤其对于高龄患者而言，医师希望尽可能地控制多胎妊娠率。因此，在这一类患者中，建议进行单胚胎移植。目前随着囊胚培养技术的成熟，选择性单个囊胚移植能够显著降低多胎妊娠率。然而，单胚胎移植是否会导致临床妊娠率降低,对于高龄患者应该移植几个胚胎、移植怎样的胚胎，这些问题值得医师研究。

资料与方法

一、资料

回顾性分析2010 年1 月至2018 年6 月期间，因输卵管因素、男方因素或不明原因于上海交通大学医学院附属第九人民医院辅助生殖科行体外受精-卵细胞质内单精子显微注射（intracytoplasmic sperm injection,ICSI）助孕治疗后行冷冻胚胎移植的7 107 例高龄患者（40 岁≤年龄≤50 岁），其中移植冷冻单个卵裂期胚胎（移植受精第3 天的胚胎，D3 组）的患者共1 363 例，移植冷冻双卵裂期胚胎（移植2 枚第3 天的胚胎，2D3 组）的患者共5 248 例，移植冷冻单个囊胚[移植第5 天或第6 天的胚胎，囊胚移植（blastocyst transfer,BT）组]的患者共495 例。

二、方法

1.胚胎冷冻和复苏：使用Cryotop 载体系统（Kitazato Biopharma Co.）进行冷冻卵裂期胚胎和囊胚的玻璃化程序。将15%乙二醇、15%二甲基亚砜和0.5 mol/L 蔗糖的混合物用作冷冻保护剂溶液。解冻复苏时，依次使用1.0、0.5 和0 mol/L 蔗糖的溶液作为冷冻保护剂稀释液。除第一加热步骤在37 ℃进行之外，所有玻璃化和加热步骤均在室温下进行[3]。

2.内膜准备方案和胚胎移植：根据患者情况，选择促排卵周期和激素替代周期。移植胚胎数≤2 个。对于有规律的排卵患者，采用促排卵周期，当患者的优势卵泡直径>18 mm 时，采用人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin,HCG）（5 000 IU，上海丽珠制药公司）诱发排卵。对于月经不规律的患者，采用激素替代周期，从月经第3 天起使用雌二醇片（芬吗通，美国雅培贸易公司，4 mg/d）。患者通过口服地屈孕酮(达芙通，美国雅培贸易公司)或者雌二醇地屈孕酮（芬吗通，美国雅培贸易公司），阴道塞入黄体酮软胶囊（安琪坦，法国Laboratoires 公司）进行黄体支持[4]。分裂期胚胎解冻和移植安排于孕激素使用3 d 之后，囊胚期胚胎的解冻和移植后延2 d。

3.妊娠结局评价：在移植后14 d 行血HCG 检测，如血HCG 阳性（＞25 IU/L），确定为生化妊娠；在移植后28 d 行阴道B 超检查见妊娠囊及原始心管搏动者确定为临床妊娠。凡妊娠满28 孕周（196 d）至37 孕周（259 d）间分娩的定为早产。低出生体重（low birth weight,LBW）是指出生体重＜2 500 g。活产定义为孕期满或至少满22 周的活胎分娩（有呼吸、心跳、脐带搏动或随意肌的明确运动）或在孕周不清楚的情况下，如新生儿的体质量大于500 g 也可定义为活产[5]。

4.统计学处理：采用SPSS 23.0 软件对数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，计量资料采用单因素ANOVA 方法，采用Bonferroni 法进行2 组间比较；计数资料用%（n/N）表示，用χ2检验或者Fisher’s 确切概率法进行组间比较。Logistic 回归先采用单因素Logistic 回归，将P＜0.1 的变量纳入多因素Logistic 回归，采用后退法，筛选出最后进入方程的变量。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

结 果

一、3 组患者的基本资料

移植D3 组、2D3 组、BT 组间两两比较，不孕年限、体质量指数（body mass index，BMI）、不孕类型上的差异无统计学意义，但在年龄、不孕原因、授精方式上的差异均有统计学意义（见表1）。

二、3 组妊娠结局比较

D3 组、2D3 组与BT3 组间的内膜准备方案有显著差异（P<0.001）。每种方案所对应的内膜厚度上，D3 组与2D3 组间差异有统计学意义，而D3 组与BT 组间无差异。3 组（D3、2D3、BT）在生化妊娠率（14.45%比27.32%比34.75%）、临床妊娠率（11.67%比23.02%比30.91%）、活产率（6.53%比13.38%比18.38%）上差异均有统计学意义，其中2D3 组的双胎活产率最高（1.12%比7.98%比1.10%），与其余2 组比较,差异有统计学意义（P=0.002）。2D3 组的早产率最高（D3 比2D3 比BT）（6.72%比9.69%比7.69%）、低体重出生儿百分比最高（8.89%比10.69%比6.52%），同时出生缺陷发生率最高（0 比0.92%比0），但3 组间比较，这些差异尚无统计学意义（见表2）。

三、高龄患者活产率的相关因素

首先将患者年龄、不孕年限、BMI、内膜厚度、不孕原因、授精方式、内膜准备方案、孕次分组和分组（D3、BT、2D3），根据是否获得活产进行单因素Logistic 回归（见表3），然后将P＜0.1 的因素纳入多因素Logistic 回归（见表4）。结果发现，患者的年龄越大（OR=0.685,95%CI 为0.654～0.718）、BMI 越高（OR=0.961,95%CI 为0.935～0.987）、内膜准备方案采用激素替代周期（以促排卵方案为参考，OR=0.736,95%CI 为0.631～0.857），则活产率越低；而内膜厚度越厚（OR=1.058,95%CI 为1.024～1.094），活产率越高（P＜0.05）。以2D3 作为参照组，D3 组的活产率较低（OR=0.558，95%CI 为0.440～0.707，P＜0.001）；BT组的活产率有较高的趋势（OR=1.257，95%CI 为0.977～1.617，P=0.075）。本研究高龄患者的活产率与不孕年限、不孕原因、孕次分组无关。

表1 3 组患者基本特征比较

表2 3 组的移植结局比较[n(%)]

表3 高龄患者活产率的单因素Logistic 回归

表4 高龄患者活产率的多因素Logistic 回归

四、不同年龄的3 组患者活产率（见图1）

从图1 中可以看到3 组患者的活产率均随着年龄升高而下降，且在不同年龄中，活产率均呈现出BT 组高于2D3 组，2D3 组高于D3 组。

图1 不同年龄3 组患者活产率

讨 论

本研究对高龄患者（40～50 岁）的冷冻胚胎移植结局进行了探讨，分别比较了移植单个卵裂期胚胎（D3 组）、双卵裂期胚胎（2D3 组）以及单个囊胚（BT 组）的妊娠结局，发现2D3 移植组双胎活产率高，在进行多因素回归后，本研究发现BT 组的活产率与2D3 相比，差异没有统计学意义。同时，本研究分年龄进行活产率比较，在每个年龄段中，BT 组均呈现活产率最高的趋势。

目前，有关于单个囊胚移植和双卵裂期胚胎移植的文献报道较少，Zander-Fox 等[6]发现单个囊胚移植和双卵裂期胚胎移植妊娠结局相似，但可以减少多胎妊娠率。梁明明等[7]发现，在≤35 岁以及＞35 岁的患者中，单个囊胚移植和双卵裂期胚胎移植患者的活产率均无差异。Wang 等[8]分析了各个不同年龄段以及移植不同时期胚胎的临床结局，发现在＜35 岁的分组中，单个囊胚移植和双卵裂期胚胎移植的活产率基本类似，但在≥35 岁的组中，单个囊胚移植的活产率（77.6%）尤其是获得健康活产（定义为≥37 周，体质量≥2 500 g）的百分比明显更高。

对于高龄患者而言，单个囊胚移植的活产率能够与双卵裂期胚胎移植活产率类似的原因主要有可能有以下两点。第一，在培养囊胚的过程中，医师可以对胚胎进行进一步的筛选，在卵裂期阶段，胚胎发育主要由母源性RNA 和蛋白质进行调控，而能够发育至囊胚阶段的胚胎，因其自身基因组被成功激活，进而可以调控整个胚胎的发育[9]。本研究对于卵裂期胚胎的评级主要根据其形态，并不能准确反映其胚胎染色体情况，这类患者移植卵裂期胚胎的成功率可能会比较低。因此，对高龄患者进行囊胚培养可以筛选出具有较高发育潜能的胚胎，淘汰部分发育潜能差的胚胎，最终能够提高活产率。第二，囊胚移植更符合生理现象，因其接近子宫内膜“种植窗”，更符合生理着床时间，使得胚胎发育和内膜同步性更好[10]。我科大部分均采用的是冷冻胚胎移植，消除了一部分由于移植新鲜胚胎导致的高雌激素状态的影响。

就多胎率而言，单个囊胚移植仅有一个发生双胎妊娠，但是双卵裂期胚胎移植的双胎妊娠率为7.98%，且其将导致新生儿出生体质量偏低，由此，研究可以得出结论，单个囊胚移植不仅妊娠率以及活产率高，且能有效控制双胎活产率。

本研究对大于40 岁的患者进行了按照年龄的分层分析，发现在相同年龄情况下，单个囊胚移植均表现出一定的优势。结果说明在高龄患者中，进行单个囊胚移植确实是一种可行的方法。对于高龄患者而言，其本身的特征决定了这一类人群治疗的困难程度。目前，国际上关于这类人群的治疗观点也有所不同。在《中国高龄不孕女性辅助生殖实践指南》中指出[11]，对于高龄女性应该仔细评估、积极治疗，但是目前尚无特别有效的手段。

本研究回顾了我中心大于40 岁患者的冻融胚胎移植情况，且应用多因素Logistic 回归进行了其他混杂因素的矫正，比较了单个卵裂期胚胎、双卵裂期胚胎以及单个囊胚期胚胎移植的妊娠情况，能够为临床治疗提供一定的帮助。但本研究为回顾性研究，近些年来随着囊胚培养技术的提高和国家政策的倡导，单个囊胚移植的患者逐渐增加，但本组单个囊胚移植组的患者仍然相对较少，因此还需要随机对照实验来进一步证实本研究的结论。

总之，高龄患者（≥40 岁）在进行冷冻胚胎移植时，应优先考虑单个囊胚移植，可以获得较高的活产率，同时可有效控制其多胎妊娠率，增加产科安全性。