乌头汤对脂多糖诱导大鼠软骨细胞炎症反应的影响

谢新宇 梅阳阳 付长龙 邱志伟 林晴 黄艳峰 郑春松

【摘 要】目的：基于核转录因子-κB（NF-κB）炎症相关信号通路，观察乌头汤水提物对脂多糖（LPS）诱导体外培养软骨细胞炎症模型的影响。方法：①制备乌头汤水提物;②分离、培养软骨细胞;③噻唑蓝（MTT）法检测乌头汤对LPS诱导软骨细胞活性的影响;采用Western Blot法检测NF-κB p65、IκB激酶复合物（IKK）、磷酸化核因子κB抑制蛋白（pIκB）含量表达。结果：①MTT实验结果显示，乌头汤水提物对LPS诱导软骨细胞的最佳干预时间和浓度分别为24 h和150 μg·mL-1;②Western Blot检测结果显示，乌头汤水提物100 μg·mL-1组、150 μg·mL-1组、200 μg·mL-1组对LPS诱导的软骨细胞干预24 h后，可调节与炎症相关的NF-κB p65、IKK、pIκB含量表达，尤其以乌头汤水提物150 μg·mL-1组变化显著（P < 0.01）。结论：乌头汤通过降低LPS诱导的软骨细胞中与炎症相关的NF-κB途径调节因子含量表达，发挥抗炎作用。

【关键词】 骨关节炎;乌头汤;软骨细胞;炎症反应;大鼠

【ABSTRACT】Objective：Based on the signal pathway related to the nuclear transcription factor-κB（NF-κB）inflammation，to observe the effect of water extract of Wutou Tang（乌头汤）on lipopolysaccharide（LPS）-induced inflammatory model of chondrocytes in vitro.Methods：①The water extract of Wutou Tang was prepared;②Chondrocytes were isolated and cultured;③MTT method was used to detect the effect of Wutou Tang on LPS-induced chondrocyte activity;and Western Blot method was used to detect the expression of NF-κB p65，IKK，PIκB.Results：①MTT assay showed that the best intervention time and concentration of Wutou Tang water extract on LPS-induced chondrocytes were 24 hours and μg·mL-1 respectively;②Western Blot assay showed that after 24 h intervention to the LPS-induced chondrocytes in the 100 μg·mL-1 group，the 150 μg·mL-1group and the 200 μg·mL-1 group，the protein expression of NF-κB p65，IKK，PIκB related to inflammation could be regulated especially the 150 μg·mL-1of Wutou Tang water extract changed significantly（P < 0.01）.Conclusion：Wutou Tang plays an anti-inflammatory role by reducing the expression of NF-κB pathway regulatory factor in LPS induced chondrocytes.

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种由生物因素及力学异常失稳等因素致使膝关节部位的关节软骨变性退化、渐行性破坏或伴骨赘继发性增生为主的慢性关节疾病，临床常以膝关节慢性疼痛、活动受限乃至僵硬等症状伴随始终，致残率颇高[1-2]。因此，减轻患者疼痛并改善其关节功能是目前治疗KOA的首选策略[3]。

乌头汤源于张仲景的《金匮要略》，具有扶正祛邪、利达关节之效，兼可祛风寒逐湿邪，发挥除痹消痛作用，整体切合膝骨痹的治疗病机，本方由乌头、麻黄、黄芪、芍药、甘草组成，其中君药乌头可入足厥阴肝经与足少阴肾经，其性疏利迅捷，通达关腠，破膝骨痹之寒凝之力甚捷，故治疗历节胀痛、不可伸屈疗效独特[4]。临床研究显示，乌头汤可有效改善KOA患者临床症状，延缓疾病进展[5]。

经外界刺激后，异常致炎因子脂多糖（LPS）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）等可与软骨细胞表面对应受体结合，并通过胞质侧结构域招募相关的接头蛋白，而此部分接头蛋白可吸引并激活发生核因子κB抑制蛋白（IκB）激酶复合物（IKK）[6]。相关研究发现，通过将IKKβ基因转移至正常大鼠關节内，可诱发炎性病理改变（关节严重肿胀）等关节炎症状[7]。而激活后的IKK可通过诱导IκB的两个保守丝氨酸残基发生磷酸化，其中随着磷酸化核因子κB抑制蛋白α（pIκBα）的产生与释放，在泛素化作用下，IκB可在蛋白体（26 S）作用下发生降解，随后处于降解后状态的IκB与核转录因子-κB（NF-κB）p65发生分离（即NF-κB p65脱离IκB的抑制作用），发生活化的NF-κB p65进入细胞核，最终导致一系列炎症反应的发生[8]。

因此，本实验通过制备软骨细胞炎症模型，观察乌头汤对LPS诱导后软骨细胞中NF-κB信号通路中关键信号分子水平表达情况，探究乌头汤延缓KOA大鼠软骨退变的抗炎作用机制，为其临床应用提供科学的实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 4周龄SPF级健康SD雄性大鼠25只，体质量（90±5）g，购自斯莱克（上海）实验动物有限责任公司，动物合格证号SCXK（沪）2012-0002，饲养环境常年温度控制在23～25 ℃，湿度55%～60%，每小时换风16次，12 h光照/12 h黑暗自动控制循环光照条件。清洁级医学实验动物环境设施由福建中医药大学实验动物中心提供，使用许可证号SYXK （闽） 2014-0001。实验中对动物处置符合科技部2006年《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。

1.2 主要试剂 乌头汤（药物组成：制川乌6 g、麻黄9 g、黄芪9 g、白芍9 g、炙甘草9 g），药材购自福建中医药大学附属第三人民医院;噻唑蓝（MTT，Sigma）;磷酸盐缓冲液（HyClone）;DMEM/LOW GLUCOSE（生产批号NZK1239，HyClone）;PMSF蛋白酶抑制剂、蛋白上样缓冲液、质量分数为30%的聚丙烯酰胺、Tris（pH = 8.8与pH = 6.8）、十二烷基磺酸钠（SDS）、10 × 电泳液、过硫酸铵（AP）、ECL发光显影液（上海碧云天生物技术有限公司）;10×TBST（北京索莱宝科技有限公司）;玻板（生产批号1653311，美国BIO-RAD公司）;一抗（兔抗）：NF-κB p65、IKK、pIκB;二抗（羊抗兔）（美国CST公司）;1-StepTM Transfer Buffer（生产批号PA196400，Thermo）。

1.3 主要仪器 荧光型显微镜（Olympus，TKO）;无菌操作台（AIRTECH型，苏州安泰）;CO2恒温培养箱（BB16/BB5060型，德国Heraus公司）;凝胶成像系统（GELDOC2000型，美国BIO-RAD公司）;离心机（5417R型，德国Eppendorf公司）等。

2 方 法

2.1 乌头汤水提物的制备 乌头汤水回流提取

2次，每次2 h，合并提取液，抽滤，浓缩成浸膏，60 ℃水浴蒸干至恒重;待经低温下研磨成粉末状，精确称量浸膏50 mg，加入质量分数为5%的FBS培养基5 mL溶解，超声10 min，再经0.22 μL无菌滤嘴滤过后4 ℃冰箱保存备用，配成10 mg·mL-1乌头汤水提物母液，备用。

2.2 软骨细胞的分离和培养 其步骤依次为：质量分数为2%的戊巴比妥钠（40 mg·kg-1）麻醉成功后，每次人工处死大鼠3只（经行脱颈椎式），浸泡消毒，离断至双侧膝关节以上骨骼，PBS缓冲液冲洗净，再次浸泡消毒，暴露关节腔，按层次分离关节软骨，集中后经剪碎处理（1 mm3/单位体积），PBS缓冲液冲洗3遍及以上，质量分数为0.2%的Ⅱ型胶原酶消化，无菌试管收集消化后的上清液（每次2 h，重复3次），高速离心后弃上清液，移液器代液状态轻柔吹打沉淀，计数板计数（2×105·mL-1），种植原代细胞于培养瓶进行孵化培养，48 h后初次换液，鏡下观察细胞铺满绝大数瓶底，PBS缓冲液冲洗倒净，胰酶消化进行传代培养，标为第1代软骨细胞。以同样方法传至第3代细胞，镜下观察分析比较后，选取状态及活性最佳的第2代软骨细胞进行后续实验。

2.3 软骨细胞致炎模型的复制 以洁净培养瓶（规格4 mL/瓶）为载体培育第2代软骨细胞（计数2500个·mL-1），置于37 ℃培养箱中（含体积分数为5%的CO2）孵育细胞，每隔24 h更换一次培养液，待软骨细胞沿瓶壁生长占满约90%的空间时，按本课题组前期造模方式[9]，经10 ng·mL-1LPS干预软骨细胞8 h后复制软骨细胞炎症模型。

2.4 MTT比色试验测定软骨细胞活性 以96孔板为载体培育经计数为2×103/孔的第2代软骨细胞24 h后，再饥饿细胞同步培养12 h，弃去旧液，标记分组并进行干预。①空白对照组：使用移液枪添加100 μL体积/单孔的软骨细胞培养基（含体积分数为10%的胎牛血清的DMEM）。②模型对照组：先向每反应孔中加入含LPS（10 ng·mL-1）的培养基100 μL体积，待反应8 h后倒净旧液，再添加100 μL体积/单孔的软骨细胞培养基（含体积分数为10%的胎牛血清的DMEM）继续培养。③乌头汤水提物各浓度（50，100，150，200，400，600 μg·mL-1）组：向反应孔中加入剂量为10 ng·mL-1的LPS培养基100 μL，作用8 h后，更换为乌头汤水提物各浓度组分别培养6，12，24，48 h。后续操作依次为：弃净每孔旧液，37 ℃温箱MTT（每孔100 μL）反应5 h，二甲基亚砜（DMSO）振荡条件下反应10 min （100 μL/孔），酶标仪570 nm波长下检测每孔OD值并记录与分析。

2.5 Western Blot检测NF-κB p65、IKK、pIκB蛋白含量表达 在6孔板各孔中央部接种含有第2代

软骨细胞的重悬液（1×105个·mL-1），待软骨细胞爬片孵育后，标记分组并进行干预。①空白对照组：使用移液枪添加2 mL体积/单孔的软骨细胞培养基（含体积分数为10%的胎牛血清的DMEM）。②模型对照组：先向每反应孔中加入含LPS（10 ng·mL-1）的培养基2 mL体积，待反应8 h后倒净旧液，再添加2 mL体积/单孔的软骨细胞培养基（含体积分数为10%的胎牛血清的DMEM）继续培养。③乌头汤100 μg·mL-1组：向反应孔中加入剂量为10 ng·mL-1的LPS培养基2 mL，作用8 h后更换为100 μg·mL-1浓度乌头汤水提物继续培养24 h。④乌头汤150 μg·mL-1组：向反应孔中加入剂量为10 ng·mL-1的LPS培养基2 mL，作用8 h后更换为150 μg·mL-1浓度乌头汤水提物继续培养24 h。⑤乌头汤200 μg·mL-1组：向反应孔中加入剂量为10 ng·mL-1的LPS培养基2 mL，作用8 h后更换为200 μg·mL-1浓度乌头汤水提物继续培养24 h。各组软骨细胞经干预后，弃去原培养基，移液枪吸入预冷的PBS缓冲液4 mL后进行轻柔振荡漂洗，共计2次;倒掉瓶内PBS，调至20 μL移液枪，充分吸净瓶内视野面中的PBS残留，加入预冷的RIPA裂解液（含1 mmol·L-1 PMSF），转移至4 ℃冰箱充分裂解，每隔10 min轻轻摇匀，以使裂解液充分裂解全部细胞，共计3次;使用无菌细胞刮刀紧贴瓶壁由上而下，由左至右进行刮取（冰上操作），并收集至提前预冷的EP管中;冰盒内转移EP管至提前预冷的4 ℃高速离心机中，以15 000 r·min-1离心20 min，离心半径10 cm，然后取出EP管，插入冰盒内，移液枪轻轻吸取上清，并转移至提前标记且预冷的新的EP管中，此为提取的软骨细胞蛋白。进行蛋白定量分析（BCA法）后，配制体积分数为12%的分离胶与体积分数为5%的浓缩胶，进行上样（20 μg/孔），电泳条件为：恒流下，以20 V电压先跑10 min，再调制50 V电压跑30 min，最后调整到100 V电压跑至分离胶底部;转膜、封闭、杂交（NF-κB p65、IKK、pIκB的一抗浓度1∶1000）、显影及分析。

2.6 統计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用t检验与单因素方差分析;计数资料采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 软骨细胞观察 镜下观察细胞外观形态近似圆形，大小基本一致，且遮光性强为原代软骨细胞;大鼠软骨细胞原代培养2 d后大多数软骨细胞开始紧贴壁生长，形似扁平状;培养6 d后，软骨细胞开始聚集重叠并沿瓶壁扩散生长，呈现“簇团样”集聚，外观以圆形或椭圆形为主;8 d后细胞分布均匀，边界清晰，形态结构一致，呈明显的铺路石状外观;本实验使用第2代软骨细胞。见图1。

3.2 MTT比色试验测定软骨细胞活性结果 MTT法检测乌头汤水提物在不同浓度（0，50，100，150，200，400，600 μg·mL-1）及不同时间（6，12，24，48 h）对软骨细胞活性的影响。经乌头汤水提物各浓度组干预24 h时对软骨细胞活性影响：模型对照组OD值均明显低于空白对照组（P < 0.01），乌头汤水提物不同浓度组（50，100，150，200，400，600 μg·mL-1）干预24 h后的OD值均高于模型对照组（P < 0.05或P < 0.01），且以150 μg·mL-1组最高，差异有统计学意义（P < 0.01），见图2（1）。经150 μg·mL-1乌头汤水提物组干预各时段后对软骨细胞活性影响：24 h的OD值较6，12，48 h明显升高，差异有统计学意义（P < 0.01），见图2（2）。从而得出，乌头汤水提物干预退变软骨细胞后，对其活性具有一定的时效-量效关系，其最佳干预时间和浓度分别为24 h和150 μg·mL-1。

3.3 Western Blot结果 Western Blot结果显示，  乌头汤水提物干预经LPS诱导的软骨细胞后，可下调NF-κB p65、IKK、pIκB 蛋白含量表达。与空白对照组比较，模型对照组NF-κB p65、IKK、pIκB蛋白含量均显著升高，差异有统计学意义

（P < 0.01）;在NF-κB p65、IKK、pIκB指标上，与模型对照组比较，乌头汤水提物组（100，150，200 μg·mL-1）的蛋白含量均显著降低，其中以实验2组（乌头汤水提物150 μg·mL-1）蛋白含量的表达影响显著（P < 0.01）。提示乌头汤水提物可通过调控NF-κB p65、IKK、pIκB蛋白含量表达，在一定程度上抑制炎症反应程度，进而延缓软骨细胞的退变进程。见图3、图4。

4 讨 论

KOA属中医学“膝骨痹”范畴，多为气血、肝肾亏虚引起筋骨失养，外加风寒湿邪侵袭，留驻关节，以及外伤劳损加剧病变，致使痹证日久，邪气久羁，深筋入骨，气血不畅，经络郁阻，故关节肿痛，不可伸屈。中医病机为“本虚标实”“本痿标痹”[10]。乌头汤临床上治疗KOA具有良效，究其原因，乌头汤温阳祛湿、散寒止痛、补益气血、利达关节之功切合KOA病机，可内外兼顾，进而发挥祛因通痹的作用[11]。方中君药制川乌温阳下行，开关节祛寒湿，通经络逐冷痹;臣药麻黄性辛温，可行宣散风寒、通利气机之效，君主臣佐，两药配伍，可加强祛风散寒、除湿行痹的作用;黄芪补益气血、实卫肌表，同时又可兼解君臣两药之辛热过盛之功;芍药酸甘化阴，养血调经;炙甘草可散表寒、补中益气，同时还可调和药性，解川乌之毒[12]。

课题组前期研究发现，乌头汤可下调大鼠血清和关节液中IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-3水平，发挥抑制炎症反应的作用，进而延缓软骨退变[13]。由此提示，乌头汤发挥抗炎镇痛作用的机制可能为调控与炎症相关的信号通路分子水平的表达。为进一步研究其作用机制，课题组以NF-κB信号通路为切入点进行了深入研究。NF-κB蛋白作为转录因子家族蛋白重要成员之一，在炎症反应、细胞凋亡、免疫调节中起到重要的作用。通常，NF-κB在体内主要以p50和p65结合构成的异二聚体形式存在。正常状态时，NF-κB（p50/p65）与抑制蛋白IκB结合，使其处于失活状态，当聚合物受到外界病原因素（如LPS、IL-1β、TNF-α等）刺激后，可激活TAK1，导致IκB被磷酸化发生降解，活化后的二聚体从细胞质内移到细胞核内，实现转录。换言之，LPS等炎症因子可引起NF-κB信号通路的活化，而此通路的活化又可诱导炎症因子形成，进而加剧炎症反应对关节软骨的损害[14]。本研究结果显示，乌头汤水提物可调控LPS诱导的软骨细胞中NF-κB p65信号通路中的关键调节因子NF-κB p65、IKK、pIκB的蛋白含量表达，在一定程度上抑制炎症反应，进而延缓LPS诱导的软骨细胞退变进程。

综上所述，乌头汤水提物可通过调节LPS诱导的致炎软骨细胞与NF-κB p65信号通路相关调节因子含量表达，发挥抗炎作用，但其基于相关Lnc RNA与微小mRNA的微观调控机制及乌头汤的干预机制仍有待深入探讨。

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收稿日期：2019-07-11;修回日期：2019-08-23