27nt-miRNA 通过靶向哺乳动物雷帕霉素靶蛋白调控血管平滑肌细胞凋亡及其分子机制研究

李丹，杨鹏，滕红丽，颜渊鸳，罗雪兰，欧和生

血管平滑肌细胞（VSMC）是血管壁中层的主要细胞，可调节动脉血管张力并稳定血流动力学，其凋亡参与心血管疾病进程[1]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是结构复杂的丝/苏氨酸蛋白激酶，在调节细胞生长增殖等方面起重要作用。研究表明，VSMC 凋亡时伴随着mTOR 磷酸化水平改变[2]。微小RNA（miRNA）是一类长约18～25 个核苷酸（nt）内源性非编码RNA，可与靶基因的3'非翻译区（3'UTR）结合降解mRNA 或抑制其翻译和表达[3]。新近研究表明，miRNA 靶向激活mTOR 信号通路升高mTOR 蛋白磷酸化水平从而降低VSMC 活性[4]。此外，miRNA可以调控凋亡相关基因上调VSMC凋亡水平，产生心血管保护效果[5]。27nt-miRNA 为来源于内皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因第四内含子中的27 碱基重复序列[6]。前期研究发现，27nt-miRNA 以增强子的方式内源性调节 eNOS 基因的转录效率，下调eNOS mRNA 和蛋白表达水平[7]。此外，激活eNOS表达可增强VSMC 凋亡易感性[8]。因此，本研究采用mTOR 抑制剂雷帕霉素诱导大鼠主动脉VSMC 凋亡模型，从细胞凋亡的角度探究27nt-miRNA 对VSMC 凋亡水平的调控及潜在分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株与试剂

细胞株：大鼠原代主动脉VSMC（普诺赛公司，中国）。试剂：慢病毒载体（吉凯基因有限公司，中国）；雷帕霉素（solarbio 公司，中国）；CCK-8 试剂盒（MCE 公司，中国）；膜连蛋白-别藻青单白/7-氨基放线菌素D（Annexin V-APC/7-AAD）凋亡试剂盒（联科公司，中国）；碘化丙啶（PI/RNase）染料（BD 公司，美国）；RNA 提取试剂盒（Axygen 生物公司，美国）；逆转录试剂盒、SYBR 荧光定量PCR 试剂盒（Thermo Fisher Scientific 公司，美国）；兔抗mTOR、磷酸化-mTOR（p-mTOR）、B 淋巴细胞瘤-2（Bcl-2)、Bcl-2 相关X 蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）I抗及抗兔Ⅱ抗均购于美国Cell Signaling Technology 公司。PCR 引物由上海生工生物有限公司合成，序列见表1。

表1 基因及引物序列

1.2 27nt-miRNA 慢病毒载体质粒的构建与鉴定

以eNOS 第四内含子中27 碱基重复序列5'-GA AGTCTAGACCTGCTGCAGGGGTGAG-3'为根据，设计27nt-miRNA 高表达慢病毒颗粒LV-GV367-27ntmiRNA；同时根据其反义序列及随机对照序列构建LVGV367-anti-27nt-miRNA 和LV-GV367-NC。可 采 用qRT-PCR 法验证转染细胞株是否稳定表达目的基因。

1.3 大鼠原代主动脉VSMC 转染与分组

取对数生长期的细胞，3 种慢病毒载体分别转染细胞，细胞分为五组：空白对照组、雷帕霉素组、27nt-miRNA 组、27nt-miRNA反义序列（anti-27ntmiRNA）组、阴性对照组。27nt-miRNA 组：转染27ntmiRNA 正义链慢病毒载体；anti-27nt-miRNA 组：转染27nt-miRNA 反义链慢病毒载体；阴性对照组：转染随机阴性序列慢病毒载体。除空白对照组外，其余各组细胞给予100 ng/ml 雷帕霉素培养2 h 诱导凋亡。

1.4 慢病毒转染前后VSMC 的27nt-miRNA 表达量与各组mTOR 相对表达量

采用荧光定量逆转录PCR（qRT-PCR）法提取各组的细胞总RNA，按试剂盒说明书进行逆转录和上机检测，27nt-miRNA 检测以U6 作为内参，mTOR 检测以GAPDH 为内参，2-△△Ct表示相对表达量。上机条件：95 ℃ 10 min，40 个循环：95℃ 10 s、60℃ 60 s。

1.5 CKK-8 测定细胞毒性/增殖能力

如文献[9]所述，步骤如下：细胞以8×103个/孔接种到96 孔板，除空白对照组外，其余各组细胞给予100 ng/ml 雷帕霉素培养2 h 诱导凋亡。然后每孔加入110 μl 新配制CCK-8 液（含CCK-8 液10 μl），37℃避光孵育1 h，酶标仪450 nm 波长测定吸光度值（A450 nm）。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡率

如文献[10]中所述，步骤如下：收集各组细胞，取适量Binding Buffer（1×）重悬并调节细胞密度至5×105/ml，取100 μl 细胞悬液置于流式管中，加入5 μl Annexin V-APC 和10 μl 7-AAD，室温避光孵育15 min，加入400 μl Binding Buffer（1×），上机检测。

1.7 流式细胞仪检测细胞周期

按照文献[11]所述，方法如下：收集各组细胞，加入预冷的70%酒精4℃固定过夜。次日弃掉固定液，取500 μl PI/RNase 染料混悬细胞，避光孵育30 min，上机检测。

1.8 蛋白免疫印迹（Western blot）法检测各基因的蛋白表达量

收集各组细胞并裂解提取总蛋白。分别取各组总蛋白40 μg 进行SDS-PAGE 电泳并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。封闭1 h 后加入mTOR、p-mTOR、Bcl-2、Bax和caspase-3的I抗（稀释比例1：1000），4℃孵育过夜，次日加入荧光Ⅱ抗（稀释比例1：10 000）避光孵育1 h。双色荧光扫描成像系统分析蛋白电泳条带的灰度值，以GAPDH 为内参，蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/对照组灰度值。

1.9 统计学方法

采用SPSS 25.0 统计软件进行统计学分析，实验重复3 次，数据均用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素ANOVA 方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 构建27nt-miRNA 慢病毒转染VSMC 稳转细胞株

qRT-PCR 结果显示，与空白对照组比较，27nt-miRNA 组的27nt-miRNA 表达水平显著升高9.45±2.90，同时也高于anti-27nt-miRNA 组和阴性对照组（P均＜0.05）。与此同时，anti-27nt-miRNA组的27nt-miRNA 相对表达量为0.44±0.09，较空白对照组降低了55.3%（P＜0.05），且低于27ntmiRNA 组和阴性对照组（P均＜0.05）。而阴性对照组的27nt-miRNA 表达量与正常对照组无组间差异。

2.2 27nt-miRNA 过表达增强VSMC 细胞活力（图1）

CCK-8 结果显示，与空白对照组相比，雷帕霉素组细胞A450 nm 值降低了31.3%（1.15±0.06 vs 0.79±0.02，P＜0.05），与27nt-miRNA 组A450 nm 值比较差异无统计学意义；与阴性对照组相比，27ntmiRNA 组细胞A450 nm 值增加55.26%（0.76±0.02 vs 1.18±0.04，P＜0.05）；anti-27nt-miRNA 组 细 胞A450 nm 值较其他组均显著降低（P＜0.05）。

图1 CCK-8 检测各组大鼠主动脉VSMC 的A450 nm 值（±s）

2.3 27nt-miRNA 过表达抑制VSMC 凋亡（图2）

流式细胞仪的散点图（图2A）右下Q3 象限为早凋细胞（APC+，7-AAD-），右上Q2 象限是晚期凋亡细胞（APC+，7-AAD+）。结果显示，雷帕霉素组细胞早期与晚期凋亡率显著高于空白对照组[早期：（17.56±0.56）% vs（3.63±1.11）%,晚期：（4.75±0.20）% vs（2.26±0.25）%，P均＜0.05]，其与阴性对照组相比，差异无统计学意义。27ntmiRNA 组细胞早期凋亡率与晚期凋亡率均低于阴性对照组[早期：（5.28±0.31）% vs（14.68±1.36）%，晚 期：（3.14±0.18）% vs（4.96±0.16）%，P＜0.05]，而anti-27nt-miRNA 组早期与晚期凋亡率均高于阴性对照组，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

2.4 27nt-miRNA 过表达抑制VSMC 细胞周期G1 期分裂进程（图3）

图2 流式细胞仪检测各组大鼠主动脉VSMC 的凋亡率（±s，n=3）

图3 流式细胞仪检测各组大鼠主动脉VSMC 的细胞周期分布（±s，n=3）

流式细胞术结果显示，雷帕霉素诱导细胞发生凋亡时细胞周期阻滞在G1 期（DNA 合成前期），雷帕霉素组G1 期（DNA 合成前期）细胞比例高于空白对照组，S 期（DNA 合成期）的细胞比例低于空白对照组，差异均有统计学意义[G1 期：（82.37±1.47）%vs（72.53±2.44）%，S 期：（4.03±1.40）% vs（13.10±2.03）%，P均＜0.05]。阴性对照组与雷帕霉素组在上述指标的比较无显著差异。与阴性对照组比较，27nt-miRNA 组G1 期细胞比例呈降低趋势且S 期占比较高，组间差异均有统计学意义[G1 期：（75.37±2.14）% vs（82.99±2.13）%，S 期：（8.22±1.93）% vs（4.77±1.03）%，P均＜0.05]，此外27nt-miRNA 组各细胞周期分布与空白对照组相比差异均无统计学意义；anti-27nt-miRNA 组的G1 期细胞比阴性对照组高3.55%，S 期细胞比例比阴性对照组低80.71%，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

2.5 27nt-miRNA 过表达调控促凋亡蛋白与抗凋亡蛋白的表达（图4）

Western blot 结果显示，与空白对照组相比，雷帕霉素组的Bax 和caspase-3 表达水平呈升高趋势而Bcl-2 表达水平呈下降趋势（P均＜0.05），雷帕霉素组与阴性对照组间蛋白表达水平差异无统计学意义。与阴性对照组比较，27nt-miRNA 组Bcl-2 蛋白表达水平显著升高，同时Bax 和caspase-3 蛋白表达水平均降低（P均＜0.05）；而anti-27nt-miRNA 组中各凋亡蛋白表达趋势与27nt-miRNA 组相反（P＜0.05）。

图4 Western blot 法比较各组大鼠主动脉VSMC 的Bcl-2、Bax 和caspase-3 蛋白表达水平（±s，n=3）

2.6 27nt-miRNA 过表达可抑制mTOR 基因转录与蛋白磷酸化（图5）

qRT-PCR 与Western blot 结果显示，与空白对照组相比，雷帕霉素组的p-mTOR 蛋白表达水平与mTOR mRNA 表达水平均呈下降趋势（P均＜0.05），雷帕霉素组与阴性对照组在上述指标的差异无统计学意义（P均＞0.05）。与阴性对照组比较，27ntmiRNA 组mTOR mRNA 相对表达水平与p-mTOR蛋白表达水平均降低（P均＜0.05），而anti-27ntmiRNA 组中表达趋势则相反（P＜0.05）。

图5 Western blot 法比较各组大鼠主动脉VSMC 的p-mTOR/mTOR 蛋白水平的比值以及qRT-PCR 比较mTOR mRNA相对表达水平（±s，n=3）

3 讨论

VSMC 是构成血管壁组织结构的主要细胞类型，可协调血管壁的弹性与张力并保持血流动力学稳定[1]。VSMC 异常增殖和迁移是心血管疾病的关键事件，研究发现，动脉粥样斑块区域有VSMC 异常增殖[12]。研究表明，miRNA 可调控VSMC 凋亡、侵袭和迁移，如miR-574-5p 通过抑制ZDHHC14 基因表达促进细胞增殖并抑制凋亡[13]。27nt-miRNA是来源于内皮源性eNOS 基因第四内含子中的 27碱基重复序列，本课题组的前期研究表明，27ntmiRNA 参与VSMC 收缩型的特异性平滑肌22α 基因（SM22α）调控，并抑制血管内皮细胞eNOS 基因表达及一氧化氮产物的合成[14]。在本研究中，我们构建了27nt-miRNA 过表达与反义序列慢病毒载体转染VSMC 并采用雷帕霉素诱导凋亡，CCK-8 法结果显示27nt-miRNA 过表达可增强VSMC 细胞活性，流式细胞术进一步显示细胞凋亡率显著降低且减弱细胞分裂周期G1 期阻滞。以上结果提示27ntmiRNA 可能参与调控VSMC 凋亡生理过程，那么该内含子源性miRNA 是否通过抑制与细胞凋亡有关的生长因子表达进而抑制了VSMC 的凋亡？

抗凋亡蛋白Bcl-2 通过抑制细胞色素C 的释放维持线粒体外膜完整性；而促凋亡蛋白Bax 增加线粒体外膜的通透性促进细胞色素C 进入细胞质[15]；半胱氨酸依赖性内切蛋白酶家族的caspase-3 是细胞凋亡蛋白级联反应中的下游关键蛋白[16]。mTOR 是由2 549 个氨基酸残基构成的丝/苏氨酸蛋白激酶，通过磷酸肌醇-3-激酶相关激酶家族和丝氨酸/苏氨酸激酶信号传导，调控细胞凋亡以及细胞周期和蛋白质合成等功能[17]。大量研究表明[18-19]，内源性的miRNA 对mTOR 分子信号调节参与了VSMC的增殖、凋亡和衰老等细胞功能。例如，Lee 等[20]在研究发现miR-92b-3p 可直接靶向mTOR 信号通路中负调节因子的3'-UTR 促进细胞增殖。我们的研究进一步提示，当雷帕霉素诱导经27nt-miRNA转染的VSMC 发生凋亡时，27nt-miRNA 可负调控mTOR 基因转录与蛋白磷酸化水平，促凋亡蛋白Bax 与caspase-3 表达受抑制而抗凋亡蛋白Bcl-2 表达上调，这可能是27nt-miRNA 增强VSMC 抗凋亡能力的潜在机制之一。

综上，本研究提出27nt-miRNA 抑制mTOR 介导的主动脉VSMC 凋亡，其机制可能与靶向负调控mTOR 基因转录水平与蛋白磷酸化水平并下调Bax和caspase-3 表达有关。这不仅为心血管关键基因及其VSMC 功能学研究提供重要的理论依据，且揭示了27nt-miRNA 与心血管疾病关键信号因子之间的内在关联及其潜在的临床应用。