刺络联合舒利迭吸入疗法防治小儿哮喘的疗效观察

苟小军 刘华 姚俊丽 黄勋 孔令万 陈黎

摘要 目的：探讨刺络联合舒利迭吸入疗法治疗小儿哮喘的临床疗效，并观察其用药前后的代谢组学变化。方法：选取2013年10月至2015年9月上海市宝山区中西医结合医院收治的哮喘患儿50例作为研究对象，按照随机数字表法随机分为对照组和观察组，每组25例。对照组采用沙美特罗替卡松粉吸入剂治疗，观察组在对照组治疗的基础上针刺四缝和少商穴位以及耳尖放血，间隔1 d进行1次，周期90 d。采集患儿用药前0 d，用药30 d，用药60 d，用药90 d的尿液，采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）检测尿液内源性代谢物，观察治疗前后2组患儿临床症状评分、免疫指标以及代谢谱的变化情况。结果：观察组总有效率高于对照组，2组比较差异有统计学意义（P<0.05）;与治疗前比较，2组患儿各项中医症候均明显减轻，观察组改善程度比对照组更为显著，差异有统计学意义，2组免疫学指标与治疗前比较均显著降低（P<0.05），与对照组比较（90 d），观察组（90 d）各指标降低程度更为明显，差异均有统计学意义（P<0.05）。采用有監督的分析-OPLS分析了治疗前对照组和观察组（0 d），治疗后（90 d）对照组和观察组的尿液代谢谱，结果显示4组代谢谱分离良好，鉴定了21个相关代谢标志物。结论：刺络联合舒利迭吸入疗法治疗小儿哮喘的临床效果确切，可改善患儿症状，降低免疫指标，其作用机制可能与丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢和组氨酸代谢等代谢异常有关。

关键词 刺络疗法;舒利迭吸入;儿童支气管哮喘;哮喘控制测试量表;疗效观察;代谢组学;中医证候;作用机制

Clinical Observation on the Prevention and Treatment of Asthma in Children with Joint Therapy of Meridian-Prick and Seretide Inhalation Therapy

GOU Xiaojun，LIU Hua，YAO Junli，HUANG Xun，KONG Lingwan，CHEN Li

（Department of Pediatrics，Baoshan District Hospital of Integrated Traditional Chinese Medicine of Shanghai，Shanghai 201999，China）

Abstract Objective：To investigate the clinical efficacy of prevention and treatment of asthma in children with joint therapy of meridian-prick and seretide inhalation therapy，and to study the metabolomic changes before and after drug use. Methods：A total of 50 patients selected in Baoshan District Hospital of Integrated Traditional Chinese Medicine of Shanghai，who met the inclusion criteria were randomly divided into 2 groups according to random number table，with 25 in each group. The control group was inhaled with salmeteroploxapine powder inhaler and the observation group acupunctured four sutures and acupuncture points on Shao Shang and blood on the tip of the ears on the basis of the control group. The blood was bleeded once a day and the period was 90 d. Urine was collected from patients 0 d，30 d，60 d，90 d before medication，and for 90 days for medication. Gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） was used to detect endogenous metabolites in urine，and the clinical symptom scores，immune parameters and metabolic profiles were observed before and after treatment. Results：The total effective rate in the observation group was significantly higher than that in the control group. There was a statistically significant difference between the 2 groups （P<0.05）. The TCM symptoms in the observation group and the control group were significantly reduced compared with those before the treatment （P<0.05）. The degree of improvement was more significant than that in the control group （P<0.05）. The difference was statistically significant. Both groups had significantly lower immunological parameters compared with those before treatment （P<0.05）. Compared with the control group（90 d）. The decreased degree of the indexes in the observation group （90 d）was more obvious （P<0.05），and the difference was statistically significant（P<0.05）. Additionally，the supervised analysis-OPLS was used to analyze the urine metabolic profiles of the pre-treatment control group and the observation group （0 d），and after the treatment （90 d） in the control group and the observation group. The results showed that the 4 groups were well separated and 21 related metabolic markers were identified. Conclusion：The clinical effects of pricking collateral combined with salizidine inhalation therapy for children with asthma is definite，which can improve the symptoms of children and reduce the immune index. Its mechanism of action may be related to metabolic abnormalities such as alanine，aspartate and glutamate metabolism，glyoxylate and dicarboxylate metabolism and histidine.

Keywords Meridian-pricking therapy; Seretide inhaling; Bronchial asthma with children; Asthma Control Test Scale;Clinical Observation; Metabolomics; TCM Syndrome; Mechanism

中图分类号：R725.6文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.06.010

哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，以反复咳嗽、喘息、胸闷和呼吸困难为特征，它也是儿童常见的慢性疾病之一。近年来，世界各地兒童哮喘的发病率持续上升，特别是幼儿，全国儿科哮喘协作小组在全国范围内对儿童哮喘患病率进行了两次调查，表明中国哮喘患儿患病率呈现显著上升趋势，严重威胁儿童的健康和生命[1]。伴随GINA全球哮喘处理和预防策略的普及，哮喘儿童得到了标准化治疗，但临床实践表明，儿童哮喘的诊断，治疗和预防仍存在许多问题[2]。儿科医生如何选择快速、有效、简便、经济的治疗方案，是儿科临床面临的问题。刺络放血疗法，以前被称为“刺血疗法”，也被称为“血液疗法”，“刺痛疗法”等，是一种独特的中医针灸疗法。其具有操作简单，使用方便，无不良反应，效果快，节省时间，成本低等特点，已用于上百种疾病的治疗，涉及各个临床科室，因此具有广泛的应用前景[3-4]。基于前期的研究结果，本研究选择刺络与舒利迭联合治疗儿童哮喘，对儿童哮喘的预防与控制有显著疗效，为临床治疗儿童哮喘提供一种有效、简便，易于推广且不良反应小的疗法。另外中医药对疾病诊断和治疗的作用越来越受到国内外学者的关注[5]，但由于缺乏科学的实验数据来解释中医药的作用机制。代谢组学是体内所有低分子量代谢产物在机体受到刺激或干扰后随时间变化的一种整体的系统研究技术[6]，具有把整体、动态、综合、分析融和一体的特点，与中医学的整体观念和辨证论治思维方式上不谋而合，揭示了致病因素和机体反应的共同结果，为中医学研究提供了新的思路和方法[7]，代谢组学将先进的分析技术平台与多元统计学分析相结合，分析机体整体代谢轮廓的改变情况，科学地阐释中医药对疾病的治疗效果及其作用机制[5]。因此本研究采用刺络联合吸入疗法防治小儿哮喘，能较快发挥疗效并可有效控制病情发展，动态收集患儿尿液，采用气相色谱质谱联用（GC/MS）技术，进行尿液的检测，寻找患儿尿液中特异性代谢产物，从代谢的水平探讨刺络对儿童哮喘的干预疗效及作用机制。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年10月至2015年9月间上海市宝山区中西医结合医院儿童哮喘门诊收治的哮喘患儿50例作为研究对象，按照随机数字表法随机分为对照组和观察组，每组25例。治疗过程中脱落15例，观察组实际有效病例19例，对照组16例。观察组中男10例，女9例，平均年龄（6.11±1.83）岁，平均身高（116.58±3.13）cm，平均体质量（24.0±3.13）kg，平均病程（3.8±0.92）年;对照组中男9例，女7例，平均年龄（6.31±1.89）岁，平均身高（120.88±14.94）cm，平均体质量（25.28±3.40）kg，平均病程（4.0±1.03）年。一般资料经统计学分析，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。见表1。宝山区中西医结合医院医学伦理委员会审核并同意本方案（伦理审批号：BS201301）。

1.2 诊断标准

1.2.1 西医标准 2008年中华医学会儿科学分会呼吸学组制定的儿童支气管哮喘诊断标准[8]。

1.2.2 中医标准 中华人民共和国卫生部编著的《中药新药临床研究指导原则》中肺脾气虚证中医诊断标准[9]。

1.3 纳入标准 1）既符合西医诊断标准，同时满足中医肺脾气虚证诊断标准，并未用药物治疗者;2）年龄4～12岁者;3）监护人知情同意并签署知情同意书。

1.4 排除标准 1）其他原因导致的喘息、急性哮喘发作者;2）正在接受其他疾病治疗者;3）造血系统疾病或有原发性免疫缺陷病者;4）心、肝、肾有严重疾病者;5）先天性气道畸形和小儿肺结核者等。

1.5 脱落与剔除标准 1）自行退出者（疗效太差，不良反应等）;2）失访者;3）研究者令其退出者（依从性差;出现严重的并发症;严重不良事件）;4）资料记录不全者。

1.6 治疗方法 对照组吸入舒利迭（Glaxo Wellcome Production，生产批号：EH5R）150 μg，1吸/次，2次/d，治疗90 d;观察组针刺四缝、少商、耳尖放血，隔日1次，联合舒利迭（药品与对照组相同）吸入150 μg，1吸，2次/d，治疗90 d。针刺四缝、少商、耳尖具体方法：乙醇（75%）穴位消毒后，用左手固定皮肤，右手取一次性24号不锈钢1寸半针，快速针刺，直或斜刺0.1～0.3 mm，停留几秒，出针，将针刺部位按压使针刺部位出血3～5滴，然后用棉球擦干局部血液，避免出血。

1.7 观察指标

1）观察患儿治疗前后的哮喘发作次数、呼吸道感染次数、喷嚏、鼻塞、流涕、出汗、纳呆、面色不华、乏力、便溏等临床症状改善情况。2）抽取患儿肘静脉血5 mL，离心，分离血清，-80 ℃冰箱保存。采用日本Sysmex全自动凝血分析仪进行酸性粒细胞计数，按照散射比浊法，采用IEMENS西门子特定蛋白测定仪测定外周血免疫学指标：IgG、IgA、IgM、IgE、C反应蛋白等。3）采集尿样，检测代谢组指标。

1.7.1 尿液的采集 采集患儿早晨第1次尿液的中段尿液，置10 mL离心管中密封、编号，立即于-80 ℃冰箱冷冻保存，等待检测。用药前0 d，用药30 d，用药60 d，用药90 d的早晨为样本收集的时间点。

1.7.2 试剂与仪器 1）试剂：N，O-双三甲硅基三氟乙酰胺（BSTFA+1%TMCS，sigma公司）;盐酸甲氧胺（methoxyamine hydrochloride，sigma公司）;分析纯级别的肉豆蔻酸（sigma公司）、庚烷、吡啶、甲醇（购于上药集团）。2）仪器：气相色谱仪（6890，Agilent公司）;质谱仪（5975B Agilent公司）;冷冻离心机（Centrifuge 5415R，德国Eppendorf公司）;混匀仪（Vortex-Genie 2，美国Scientific Industries公司）;氮吹仪（SBH130D/3，英国Stuart公司）。

1.7.3 样品前处理与检测

1.7.3.1 尿液前处理 取1.0 mL尿液樣品离心10 min;移取200 μL上清液于离心管中，加入尿素酶，37 ℃反应15 min;加入甲醇800 μL和肉豆蔻酸10 μL，摇匀，离心10 min，移取200 μL上清液于GC瓶中，氮气吹干;加入甲氧胺50 μL，于30 ℃，反应90 min;加入50 μL的BSTFA+1%TMCS，70 ℃反应60 min，然后加入庚烷40 μL，摇匀即可。

1.7.3.2 气相色谱/质谱（GC/MS）分析条件 气相色谱的设置：采用分流比为20∶1，进样1 μL，氦气为载气，1 mL/min的流速，280 ℃的进样口温度，230 ℃的离子源温度，150 ℃的接口温度。见表2。

1.7.4 中医证候评分 参考《中国支气管哮喘防治指南（基层版）[10]以及《中药新药临床研究指导原则》[9]有关哮喘的阐述，采用评分法对症状进行打分，每个症状分4级（无、轻、中、重），每级分别对应0、1、2、3分。观察治疗前后患儿的喷嚏、鼻塞、流涕、出汗、纳呆、面色不华、乏力、便溏等中医证候积分，无，计0分;轻度，计1分;中度，计2分;重度，计3分，分值越高代表病情越严重。

1.8 疗效判定标准 参照《支气管哮喘防治指南》中有关疗效标准拟定[11]。1）临床控制：哮喘症状完全缓解，即使偶尔轻度发作而无药物治疗，可缓解并且夜间无症状。2）显效：哮喘发作与治疗前相比明显减少，可参加日常活动和轻中度体力劳动，不能参加体育锻炼。3）好转：哮喘症状减轻。4）无效：临床症状无改善或恶化。总有效率=（临床控制+显效+好转）例数/总例数×100%。

1.9 统计学方法 原始数据经过格式转换，应用XCMS程序进行峰识别、峰过滤、峰对齐，得到一个包括保留时间、质荷比和峰强度构成的矩阵表，然后对该表进行中心化和归一化，最终该表被导入SIMCA-P11.5软件（Umetrics，Sweden）中进行监督和非监督分析。采用SPSS 21.0统计软件对研究数据进行统计，计量资料用均值±标准差（±s）表示，采用t检验。计数资料用率（%）表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组患儿疗效比较 经过90 d治疗后，观察组临床控制7例，显效6例，好转5例，无效1例，总有效率达到了94.47%。对照组临床控制4例，显效6例，好转2例，无效4例，总有效率是81.25%，观察组总有效率显著高于对照组，2组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.2 2组患儿中医症候积分比较 治疗后，2组患儿各项中医症候与治疗前比较均明显减轻，差异有统计学意义（P<0.05），且观察组改善程度比对照组更为显著，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。

2.3 2组患儿治疗前后免疫学指标比较 治疗后，2组患儿嗜酸性粒细胞计数、IgG、IgA、IgM、IgE、C反应蛋白与治疗前比较均显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）;观察组各个指标降低程度比对照组更为显著，差异有统计学意义（P<0.05）。见表5。

2.4 2组患儿尿液代谢组学变化

2.4.1 2组患儿前后代谢组学变化比较 首先使用非监督的主成份分析法—PCA，结果显示2组患儿的尿液代谢谱不能明显区分，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。为了找到与发病相关的特征变量，采用有监督的分析-OPLS，分析了治疗前后（0 d和90 d）2组患儿的尿液代谢谱，结果显示4组代谢谱分离趋势良好，并且该模型解释率和预测率均比较高（R2Y=0.65，Q2Y=0.85）。见图2。

2.4.2 2组患儿筛选潜在的生物标志物比较 基于OPLS模型，依据权重系数VIP>1。见图3。基于GC/MS本身带有的NIST代谢物库及标准品代谢物谱库，鉴定了21个差异代谢物，另外对代谢物单维浓度上的变化进行了考察，这21个代谢物可作为诊断哮喘患儿的潜在生物标志物。见表6。

2.4.3 2组患儿刺络治疗对尿液代谢谱的影响比较 图3显示，对照组治疗前后（0 d与90 d）代谢谱能很好的区分，观察组治疗前后（0 d与90 d）代谢谱也能很好的分离;治疗后2组代谢谱分离良好，而治疗后对照组的代谢谱位于治疗前对照组与观察组的中间位置，且观察组的代谢谱远离治疗后对照组的代谢谱，从代谢的角度说明，观察组在相同治疗的基础上联合刺络治疗对患儿的代谢谱产生了更大的影响，这种影响可能是刺络治疗产生的效果。另外观察组治疗前后（0 d与90 d）比较，15个物质有显著性差异，而对照组治疗前后比较，6个物质有显著性差异。说明刺络治疗对哮喘患儿的生理及代谢状况产生了更有效的干预作用。见表6。

2.4.4 2组患儿随时间变化的代谢谱分析 取对照组0 d、30 d、60 d、90 d和观察组0 d、30 d、60 d、90 d的样本分别做0PLS代谢谱，发现对照组30 d样本偏离0 d样本，向右边移动，对照组60 d样本与对照组90 d样本向右移动，位于第Ⅰ和第Ⅳ象限内，但是这2个时间点的样本交叉聚集，不能分离，说明对照组治疗90 d对患儿的代谢谱影响较小。见图4。观察组30 d样本偏离0 d样本，向右边移动，观察组60 d样本与对照组90 d样本向右移动，位于第Ⅰ和第Ⅳ象限内，但是这2个时间点的样本只有个别样本交叉，分离趋势明显，说明观察组治疗90 d对患儿的代谢谱产生交大的影响，造成这种分离的原因很可能是刺络治疗对哮喘患儿的生理及代谢状况产生了更有效的干预作用。见图5。

2.5 代谢通路分析 为了进一步阐明哮喘患儿的代谢分布，表3找到的21种潜在的生物标志物被导入在线系统-MetaboAnalyst中进行代谢通路的分析。将阈值设置为0.10[12]，原因是关键位置的阈值大于1，能严重影响事件的发生，这样的通路认为是潜在的代谢途径。见图6。

3 讨论

哮喘是常见的小儿呼吸系统疾病，属于气道炎性反应疾病，由多种细胞介导引起哮喘的发生，症状为喘息、刺激、胸闷和咳嗽等表现，通常发生在夜间或凌晨，可以重复发生[13]。儿童正处于成长和发展的关键时期，如果不及时治疗支气管哮喘，可能导致儿童气道重塑，进一步引起不同程度的可逆性气道阻塞，表现出喘息、呼吸困难和咳嗽等症状。病情危重时出现皮肤黏膜发绀、意识障碍等症状时，可能在数天或数分钟内危及生命[14]。

舒利迭是一种复方制剂，其主要成分为沙美特罗与丙酸氟替卡松沙。前者是一种选择性的长效β2肾上腺素受体激动剂，能有效解除支气管痉挛，有利于降低气道高反应性;后者是一种糖皮质激素，具有抗炎、抗过敏的功效，起到解除支气管痉挛的作用，因此舒利迭具有良好的哮喘治疗效果[15]。临床研究表明，患者长期吸入糖皮质激素疗效较好，缺点是气道炎性反应持续存在，肥大细胞等炎性反应细胞仍释放白三烯等炎性反应因子，炎性反应因子与其受体结合，促进支气管平滑肌收缩，参与了哮喘反应[16]。刺络放血疗法是一种独特的中医针灸疗法。刺络放血通过改变经络中气血虚实状态，从而调节脏腑的气血阴阳[17]。耳尖穴属于经外奇穴，《厘正按摩要术》记载，“耳皮肉属肺”。少商穴手太阴肺经“井穴”，针刺放血少许，可祛肺经之邪。四缝穴主治小儿疳疾、百日咳，四縫穴与肺、脾、肾有关系密切，针刺四缝可以通畅百脉，调和脏腑。耳尖、少商及四缝穴刺络放血疗法可到达肺、脾、肾同治，治本为主、兼以攻邪治标作用[18]。

本研究结果表明：刺络联合舒利迭吸入疗法治疗小儿哮喘的临床效果确切。针刺四缝、少商、耳尖放血联合吸入舒利迭，达到协同作用，使药物效果发挥到极致，使药物的有效作用最大化，抵制了舒利迭的不良作用。刺络放血疗法具有操作简单，使用方便，无不良反应，效果快，节省时间，成本低等特点，具有广泛的应用前景，值得在临床中大力推广。

本研究采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）检测了儿童哮喘患儿尿液中内源性代谢物的变化，采用有监督的分析-OPLS分析了治疗前对照组和观察组（0 d），治疗后（90 d）对照组和观察组的尿液代谢谱，结果显示4组代谢谱分离良好，鉴定了21个相关特异性代谢物。这21个代谢物与乙醛酸丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、二羧酸代谢和组氨酸代谢等通路密切相关，其中涉及3种通路最重要的物质是丙氨酸、乙酸、天冬氨酸、甘油酸、组氨酸以及乌头酸等。

组氨酸代谢在核酸、嘌呤、嘧啶和ATP的合成等方面发挥了重要作用，其合成與肠道菌群密切相关，组氨酸由肠道菌群代谢产生组胺[19]。组胺是过敏性疾病和炎性反应的主要递质[20]，在过敏和炎性反应的调节中发挥重要作用。在机体病理条件下，组胺与靶细胞上的特异性抗原和抗体结合，产生生物效应，释放大量的组胺，然后进入血液和组织中，导致机体发生过敏。组胺具有强大的生物活性，能够收缩呼吸道平滑肌，引发支气管痉挛和哮喘的发生[21]。本研究结果显示，组氨酸是造成观察组治疗前后代谢谱发生差异的代谢物质之一，且治疗后观察组含量较对照组降低，说明观察组刺络治疗产生了更有效的干预。

据报道[22]，与哮喘有关的代谢标记物：丙氨酸、乙酸、苏氨酸、腺苷、马尿酸、琥珀酸以及反式乌头酸等涉及到低氧反应、氧化应激、免疫、炎性反应、脂质代谢和三羧酸循环等异常代谢通路。本研究发现乌头酸、丙氨酸、乙酸、天冬氨酸、甘油酸等在观察组中有异常的变化。正常人血液中酮体含量很低，只有脂肪利用率升高，血液酮体浓度才会升高[23]。本研究结果表明，刺络联合舒利迭治疗可能与改善肺通气改善，耗能减少有关，通过改善肺通气调节体内糖代谢和脂代谢供能可能是刺络防治哮喘的一个作用机制。

谷氨酸是兴奋性神经递质，对中枢神经系统中的神经元和胶质细胞的增殖和发育、突触传递、学习和记忆等方面发挥着重要的作用。在病理条件下，过量的谷氨酸会导致神经缺血和神经退行性疾病[24]。同样体内含量低的谷氨酸也会引起病变，更直接地引起哮喘。谷氨酸水平减少会破坏氨代谢的平衡，造成机体免疫低下、抵抗力下降而引发哮喘。本研究结果显示，观察组治疗后较治疗前，谷氨酸含量上升，且高于对照组，说明患儿经过治疗后，异常的谷氨酸回归正常水平，而且观察组回归正常的趋势更大，结果提示刺络的作用机制可能与调节异常的氨基酸代谢，提高机体的抗氧化能力，改善氨转运，调节激素水平有关。

综上所述，刺络放血疗法是中医防治疾病的特色疗法，具有操作简单，使用方便，无不良反应，效果快，节省时间，成本低等特点，经过长期临床实践证明，刺络放血疗法对肺系疾病具有良好疗效。目前刺络放血疗法用于哮喘的防治，临床疗效观察方面的报道较多，而探讨其作用机制的报道相对较少。本研究探讨了刺络联合舒利迭吸入疗法治疗小儿哮喘的临床疗效，研究其用药前后的代谢组学变化。结果显示观察组总有效率明显高于对照组，采用有监督的分析-OPLS分析了治疗前对照组和观察组（0 d），治疗后（90 d）对照组和观察组的尿液代谢谱，结果显示4组代谢谱分离良好，鉴定了21个相关代谢标志物，刺络疗法的作用机制可能与丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢和组氨酸代谢等代谢异常有关。本研究为刺络的作用机制研究提供了新的研究手段，同时为哮喘发病、诊断和预后奠定了科学依据。

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（2018-10-31收稿 责任编辑：王杨）

基金项目：上海市卫计委中医薄弱领域专科建设项目（BRZK2016007）;上海市宝山区科委创新基金项目（12-E-20）作者简介：苟小军（1975.03—），男，博士，副主任药师，研究方向：临床药学与体内代谢研究，E-mail：gouxiaojun1975@163.com通信作者：陈黎（1967.06—），女，硕士，主任医师，研究方向：儿科临床常见疾病、多发病的诊断与治疗，E-mail：Lichen123456@aliyun.com