益肾祛浊方对多囊卵巢综合征胰岛素抵抗模型大鼠激素受体表达的干预作用

尹谦 王明星 许昕

摘要 目的：探索益肾祛浊方对多囊卵巢综合征胰岛素抵抗（PCOS-IR）模型大鼠激素及胰岛素受体表达的干预作用。方法：选取6～8周龄SPF级SD雌性大鼠60只随机分为空白组、模型组、益肾祛浊组、益肾组、西药组（达英-35联合二甲双胍），每组12只。空白组给予普通饲料喂养，其余各组均给予来曲唑灌胃联合高脂饲料喂养至第27天。然后给予不同药物灌胃2周，采用免疫荧光法检测各组大鼠雄激素受体（AR）、促黄体生成素受体（LHR）在卵巢、胃、肠组织的表达;并观察胰岛素受体（INSR）在卵巢的表达。结果：治疗14 d后发现，益肾祛浊方可以显著降低大鼠卵巢局部AR、LHR和INSR的表达，差异有统计学意义（P<0.05）;且明显减少胃中AR及LHR的表达，差异有统计学意义（P<0.05）;同时显著减少结肠组织LHR的表达，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：益肾祛浊方可能通过降低AR、LHR表达而调整模型大鼠内分泌紊乱，又可通过降低INSR的表达，对PCOS-IR大鼠的代谢紊异常起到治疗作用。

关键词 益肾祛浊方;多囊卵巢综合征胰岛素抵抗;大鼠模型;受体表达

Study on Intervention Effects of Yishen Quzhuo Formula on Hormone Receptor Expression in PCOS-IR Model Rats

YIN Qian1， WANG Mingxing2， XU Xin2

（1 Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China; 2 Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University， Beijing 100010， China）

Abstract Objective：To explore the intervention effects of Yishen Quzhuo Formula on the expression of hormones and insulin receptors in polycystic ovary syndrome model （PCOS-IR） rats.Methods：A total of 60 SPF level SD female rats aged 6-8 weeks were randomly divided into a blank group， a model group， a Yishen Quzhuo group， a Yishen Quzhuo group， and a Western medicine group （Diane-35 combined with metformin）， with 12 rats in each group.The blank group was fed with normal diet， and the other groups were fed with letrozole by gavage combined with high-fat diet until the 27th day.Then， different drugs were fed by gavage for 2 weeks.The expression of androgen receptor （AR）， luteinizing hormone receptor （LHR） in ovary， stomach and intestine and insulin receptor （INSR） in ovary were observed by immunofluorescence.Results：After 14 days of treatment， Yishen Quzhuo Formula could significantly reduce the expression of AR， LHR and INSR in part of ovary in rats （P<0.05）， the expression of AR and LHR in stomach （P<0.05）， and the expression of LHR in colon tissue （P<0.05）.Conclusion：Yishen Quzhuo Formula may regulate endocrine disorders in model rats by lowering the expression of AR， LHR and further exert therapeutic effects on metabolic disorder of PCOS-IR rats by reducing the expression level of INSR.

Keywords Yishen Quzhuo Formula; PCOS-IR; Rat model; Receptor expression

中圖分类号：R289.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.06.005

多囊卵巢综合征（Polycystic Ovary Syndrome，PCOS）是妇科常见的内分泌及代谢紊乱性疾病，以持续无排卵或稀发排卵、高雄激素血症或高胰岛素血症为特征，临床表现为月经稀发、闭经，或异常子宫出血、不孕不育、肥胖、多毛、痤疮、黑棘皮症等。各国报道的多囊卵巢综合征患病率在育龄期女性为5%～10%，中国为5.61%[1]。胰岛素抵抗（ Insulin Resistance，IR）是正常剂量的胰岛素产生低于正常生物学效应的一种状态，指单位浓度胰岛素的细胞效应减弱，即组织对胰岛素的敏感性下降，代偿性引起胰岛B细胞分泌胰岛素增加，从而产生高胰岛素血症[2]。Berger等[3]首次提出IR参与了PCOS的发生。据报道50%～70%的PCOS患者存在IR，肥胖型PCOS患者IR的发生率高达75%，非肥胖型约为30%[4]。多囊卵巢综合征和IR密切相关的观点已得到公认。及时纠正IR状态，改善卵巢敏感性，恢复排卵，是治疗PCOS，阻断或扭转其发展形成PCOS-IR的关键。本研究基于“肾主生殖”和“冲脉隶于阳明”的中医理论，以及前期随机对照试验、实验研究的成果[5-6]，拟继续进行动物实验，验证与阐明“益肾祛浊方”对PCOS-IR模型大鼠激素受体的干预机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取6～8周龄SPF级SD大鼠60只，体质量160～180 g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，实验动物许可证号：SYXK（京）2018-0006，在三级动物室无菌饲料喂养，饲养温度为24 ℃，湿度为60%。自由饮水，适应性喂养1周后进行实验。

1.1.2 药物 来曲唑（江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字H19991001）;羧甲纤维素钠（CMC-Na，美国SIGAMA公司，生产批号：1002375619）;盐酸二甲双胍肠溶片（北京利龄恒泰药业有限公司，国药准字H11021560）;达英-35（拜耳医药保健有限公司广州分公司，国药准字J20140114）。

益肾祛浊方由败酱草、生薏苡仁、续断、桑寄生、菟丝子等12味中药组成。单纯益肾组由益肾祛浊方中同剂量的补肾中药（菟丝子、桑寄生、续断等）组成。以上中药购自于首都医科大学附属北京中医医院。

高脂饲料（H10060，供能比：蛋白20%、碳水化合物20%、脂肪60%）;普通饲料（H10010，供能比：蛋白20%、碳水化合物70%、脂肪10%），由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，主要成分为酪蛋白、糊精、蔗糖、纤维素、豆油、猪油等。

1.1.3 试剂与仪器 进口羊血清工作液（中衫金桥，批号：18122701），Anti-Androgen Receptor antibody（艾博康上海贸易有限公司，批号：GR3179947-6）;LH Receptor antibody（美国LSBio公司，批号：LS-C393279）;Anti-Insulin Receptor（β-subunit）（Monoclonal Antibody，批号：NG1739931）;Alexa Fluor 594 Anti-Rabbit lgG（北京冠星宇科技有限公司，批号：1611）;Alexa Flour 488 Anti-Rabbit lgG（北京冠星宇有限公司，批号：1712）;含DAPI的封片剂（中衫金桥，批号：K185910L）。

超低温冰箱（中国赛默飞世尔有限公司，型号：700SERIES）、組织脱水机（德国LEICA公司，型号：ASP6025）、组织包埋机（德国LEICA公司，型号：EG1150H）、石蜡切片机（德国LEICA公司，型号：RM2255）等设备均由北京市中医研究所实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将60只大鼠按体质量排序编号，采用随机数字表法随机分为：空白组12只;模型组12只;益肾祛浊组12只;益肾组（阳性中药对照）12只;达英-35联合二甲双胍组（阳性西药对照）12只。分笼喂养，每笼3只。空白组予以普通饲料，其余各组均予以高脂饲料喂养，自由饮水。

参考来曲唑造模法[7-8]，在来曲唑灌胃基础上，加用高脂饲料喂养，建立多囊卵巢综合征-胰岛素抵抗（PCOS-IR）大鼠模型。实验期间，空白对照组大鼠予以普通颗粒饲料喂养，其余各实验组大鼠予以高脂饲料喂养;造模前大鼠适应性饲养1周。将来曲唑溶于10 g/L羧甲基纤维素中，实验组大鼠灌胃来曲唑1 mg/（kg·d），空白组大鼠同期灌服等容积等浓度的基质羧甲基纤维素，均于上午9时灌胃;连续灌胃27 d。

1.2.2 给药方法 各组给予相应组别药物灌胃，模型组及空白组给予等量生理盐水;均连续灌服14 d。制备中药水煎剂，按成人服用剂量折算成小鼠用量。

根据“动物与人体的每公斤体重剂量折算系数表”，本实验的中药剂量计算方式：中剂量=每天正常人给药剂量÷人的重量×6.25（通常默认人的重量为60 kg）。经统计，中药共194 g，由公式计算中剂量为10 g/kg。西药组药物灌胃剂量由公式得出：达英-35（醋酸环丙孕酮0.2 mg/kg，炔雌醇3.5 μg/kg），二甲双胍50 mg/kg。

1.2.3 检测指标与方法

大鼠一般情况及体质量：观察记录各组模型大鼠的形态、毛色、活动、纳食等。体质量测量：每周定时测量大鼠体质量并记录数据，绘制大鼠体质量增长变化曲线。

卵巢形态学观察：各组大鼠分别在第42天（灌胃结束后），腹腔麻醉取出大鼠左侧卵巢，清除表面血液及周围脂肪，观察卵巢形态、颜色、包膜厚度;卵巢周围脂肪剖净后，分别测量大鼠卵巢长、短径及厚度，计算卵巢体积。随后将卵巢组织用4%多聚甲醛液固定48 h，常规石蜡包埋，将石蜡包埋好的卵巢组织做成5 μm厚度的切片，做HE染色。光镜观察卵巢组织形态，计算囊性扩张卵泡、成熟卵泡或黄体数目。

卵巢组织性激素受体（AR、LHR）及胰岛素受体（INSR）的表达：采用免疫荧光技术，将卵巢组织切片经过羊血清工作液孵育后，滴加抗雄激素受体抗体（Anti-AR）、促黄体生成素受体抗体（Anti-LHR）、胰岛素受体抗体（Anti-INSR）及各自相对应荧光Ⅱ抗（F488或F594）、卵巢组织性雄激素受体（AR）、促黄体生成素受体（LHR）抗体、抗胰岛素受体及各自相对应荧光Ⅱ抗（F488或F594），再用含DAPI的荧光封片剂封片。在200倍镜下每例标本随机选取5个视野并拍照。运用IPP-6.0图像分析软件，统计每张荧光图片积分光密度值（IOD），并记录数据。

胃和肠组织中雄激素受体（AR）及促黄体生成素受体（LHR）的表达：腹腔麻醉取出大鼠胃体部及结肠部组织标本，将胃肠标本用4%多聚甲醛液固定48 h，常规石蜡包埋，将石蜡包埋好的胃肠组织做成5 μm厚度的切片。采用免疫荧光技术，将胃和肠切片经过羊血清工作液孵育后，滴加Anti-AR、Anti-LHR、相对应荧光Ⅱ抗，再用含DAPI的荧光封片剂封片。在400倍镜下每例标本随机选取5个视野并拍照。运用IPP-6.0图像分析软件，统计每张荧光图片阳性点的个数，并记录数据。

中医妇科学没有与PCOS-IR准确对应的病名，根据PCOS-IR临床症状及特征，分属于“月经后期”“闭经”“不孕”和“崩漏”等范畴。现代中医学者普遍认为，PCOS-IR的病因病机主要涉及肾、肝、脾3脏，脾肾虚是根本原因，故以补肾健脾为主要治则。最近15年来，中医药治疗PCOS报道增多，但关于PCOS-IR的研究相对较少。由于PCOS-IR病机复杂，病情较重，临床常在补肾健脾同时合并多法，如健脾化痰，补肾活血，化痰活血等。比较西医药治疗而言，中医药治疗PCOS-IR在恢复卵巢功能及自主排卵等方面具有一定的优势。

许昕教授在“肾主生殖”和“冲脉隶于阳明”理论指导下，根据30余年临床经验创“益肾祛浊方”治疗PCOS-IR。本方为寿胎丸与薏苡附子败酱散合方加减而成，以续断、桑寄生、菟丝子平补肝肾，温而不燥;败酱草、生薏苡仁清利阳明;意在清除浊热，畅通胃肠，减轻脾肾功能负荷，增强运化和气化作用。其方药可经由阳明以达冲脉，向上影响心脑，向下影响胞宫（卵巢），实即从中焦、胞宫同时切入，多靶点调节“心脑-肾气-天癸-冲任-胞宫”生殖轴。本实验证明，益肾祛浊方可显著降低PCOS-IR模型大鼠的体质量，缩小异常增大的卵巢体积，纠正卵巢多囊样改变，其效果优于单纯益肾组，且与达英-35联合二甲双胍作用相当。免疫荧光检测结果表明，中药治疗后模型大鼠卵巢局部AR、LHR、INSR的IOD值均明显低于模型组。

AR在不同组织中均可表达;也有研究发现在大鼠胃壁细胞和胃主细胞上发现有LHR的表达[18]。但性激素受体在非生殖系统组织的表达及其作用是否会对PCOS-IR产生影响，此类研究及报道罕见。本实验结果显示，SD大鼠胃和肠均有AR及LHR表达，且在PCOS-IR模型组大鼠胃中AR、LHR与肠中LHR的表达明显增高。益肾祛浊方干预后大鼠AR与LHR在胃肠道中的表达水平显著降低，其作用与达英35联合二甲双胍相当，但降低LHR在结肠表达水平的效果优于西药组;而单纯益肾中药基本不会对AR与LHR在胃肠道上的表达起到干预作用。

本实验研究显示，益肾祛浊方即可在卵巢层面降低AR、LHR和INSR的表达水平，调整模型大鼠的内分泌紊乱，又可同时在胃肠层面（即阳明）改善AR和LHR的表达，促进胃肠代谢功能趨于正常，故治疗PCOS-IR模型大鼠具有显著作用。

综上所述，中药益肾祛浊方改善大鼠卵巢多囊样变，作用于卵巢、胃肠组织的性激素受体和胰岛素受体水平，阻断高雄激素血症和IR之间的恶性循环，达到治疗PCOS-IR的良好效果。

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（2019-07-25收稿 责任编辑：杨觉雄）

基金项目：国家自然科学基金项目（81674010）作者简介：尹谦（1993.11—），男，硕士研究生在读，研究方向：中医药治疗PCOS-IR，E-mail：843938460@qq.com通信作者：许昕（1959.12—），女，硕士，教授，主任医师，博士研究生导师，研究方向：中西医结合治疗排卵障碍性疾病，E-mail：xuxindoudou@163.com