超声辅助提取山桃仁中苦杏仁苷的工艺优化

黄诚 尹红

摘要    为优化桃仁中苦杏仁苷超声波辅助提取工艺，采用单因素研究乙醇体积分数、提取温度、提取时间、液料比和超声工作时间、超声处理温度6个因素对苦杏仁苷得率的影响，在此基础上应用正交试验对提取工艺进行优化，并用HPLC法对桃仁中苦杏仁苷的含量进行测定。结果表明，最佳工艺为乙醇体积分数85%、提取温度85 ℃、提取时间60 min、料液比1∶35（g∶mL）、超声处理时间30 min、超声处理温度70 ℃，同时此条件下苦杏仁苷的得率为2.88%。

关键词    苦杏仁苷;超声波;HPLC

中图分类号    TS255        文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2020）07-0228-04                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）

Optimization  of  Ultrasonic-assisted  Extraction  of  Amygdalin  in  Wild  Peach  Seed

HUANG Cheng    YIN Hong

（College of Chemistry and Chemical Engineering，Jishou University，Jishou Hunan 416000）

Abstract    Ultrasonic was used to help extract amygdalin from wild peach seed with ethanol aqueous solution.To optimize the extraction process，the effects of operation parameters such as ethanol concentration，temperature，extraction time，liquid-solid ratio and ultrasonic treatment time，ultrasonic treatment temperature were investigated by single-factor experiments.Based on this，a orthogonal trial was used to optimize the operation parameters，and using HPLC method to determine quantitatively the content of amygdalin in wild peach seed.As the result showed，the optimum ultrasonic-associated extraction condition was ethanol concentration of 85%，temperature of 85 ℃，extraction duration of 60 min，liquid-to-solid ratio of 1∶35 g/mL，ultrasonic treatment time of 30 min and ultrasonic treatment temperature of 70 ℃，the amygdalin extraction rate could reach as much as 2.88% under such optimum condition.

Key words    amygdalin;ultrasonic;HPLC

桃仁為蔷薇科（Rosaceae）植物桃（Prunus persica（L.）Batsch.）或山桃（P. davidiana（Carr.）Franch.）的种仁，性平、味甘、苦，有小毒，归心、肝、大肠经，为常用的活血化淤中药，具有活血祛淤、润肠通便之效。桃仁主要化学成分有脂质、苷类（苦杏仁苷、野樱苷）、糖类（葡萄糖、蔗糖等）、蛋白质、氨基酸、苦杏仁酶、尿囊素酶等[1]。其中，苦杏仁苷是山桃仁中主要的药理成分。山桃仁对心脑血管疾病疗效显著[2]，也有抗癌作用[3]。研究认为肿瘤细胞无氧降解占优势，最终产物为乳酸，偏酸性环境有利于提高β-葡萄糖苷酶的活性，促使苦杏仁苷在肿瘤细胞中分解出较多的苯甲醛和氢氰酸，从而产生对肿瘤细胞的选择性杀伤作用[4]。武陵山区野山桃仁资源丰富，湘西自治州永顺、保靖、龙山和张家界市的桑植、慈利等县都进行了规模化种植，故对其开发利用意义重大。

目前，对桃仁中苦杏仁苷提取方法的研究比较多，常用的有水提法、有机溶剂提取法和超临界CO2萃取法等[5]。采用超声波辅助提取可提高效率，减少生产成本。超声波可破坏细胞壁，增加溶剂穿透力，从而提高提取率和缩短提取时间[6]。研究表明，超声波提取所得到的产品具有杂质含量低、有效成分含量高、提取时间短的优点，而且超声波本身还表现出节省能源、省时、简化操作程序、提高反应率和提取率、显著降低化学反应产生的废弃物对环境所产生的危害等优点，被广泛应用于植物天然产物的提取中[7]。

高温处理可使苦杏仁苷酶灭活，对桃仁进行高温灭酶的预处理，将有利于苦杏仁苷成分的保留。本研究通过四因素三水平的正交试验，采用高效液相色谱（HPLC）法测定苦杏仁苷，经正交试验优化桃仁中苦杏仁苷的提取工艺条件并考察其稳定性，旨在探讨超声辅助提取桃仁苦杏仁苷的工艺条件，为苦杏仁苷的开发利用提供相应途径。

1    材料与方法

1.1    试验材料

1.1.1    试验仪器。RE-52A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）、SMB-D 型微型循环水真空泵（郑州长城科工贸有限公司）;HH-2 数星恒温水浴锅（金坛市富华仪器有限公司）;DSY-2-4孔电热恒温水浴锅（北京国华医疗仪器厂）;高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）;KQ-250E型医用超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;GZX-9146 MBE电热恒温鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）;液相色谱仪（LC-2010AHT）;JA2003电子天平（上海天平设备厂）。

1.1.2    试验材料。山桃仁（湖南吉首）;石油醚、乙醇均为分析纯，甲醇、磷酸为色谱纯;娃哈哈纯净水;苦杏仁苷标准品（西安森卓生物科技有限公司）。

1.2    试验方法

苦杏仁苷提取工艺如图1所示。

1.2.1    山桃仁预处理。取经清洗、去杂后的桃仁，平铺在烘箱中进行灭酶处理，60 ℃烘10 h，取出冷却后粉碎[8]。将上述粉末过60目筛，称取细粉300 g，置250 mL锥形瓶中，加石油醚150 mL于70～80 ℃水浴搅拌提取30 min，趁热抽滤收集滤液和滤饼，重复提取3次。

1.2.2    苦杏仁苷超声辅助提取。称取5 g脱脂粕置于250 mL圆底烧瓶中，加入一定量一定浓度的乙醇，以塑料保鲜膜封口，置于超声波清洗器中，设定超声工作时间、超声处理温度，再回流提取，并设定乙醇体积分数、固液比、提取时间、提取温度，趁热抽滤并收集滤液，最后用旋转蒸发器对滤液进行浓缩，得到粗提取物。

1.2.3    单因素试验。分别探究乙醇体积分数、提取温度、提取时间、料液比、超声工作时间、超声处理温度对苦杏仁苷得率的影响。

1.2.4    優化试验。根据单因素试验结果，去除对苦杏仁苷得率影响不大的因素，选择L9（34）四因素三水平进行试验，并对其数据进行处理，得到优化工艺参数，进行验证性试验。

1.2.5    分析检测方法。采用高效液相色谱仪对苦杏仁苷标准品进行测定，求得峰面积与浓度的回归方程。再对待测溶液的峰面积进行检测，运用回归方程计算测定液中苦杏仁苷的浓度，最后换算为苦杏仁苷得率。

1.2.6    高效液相色谱仪工作条件。色谱柱为柱Eclipse XDB C18，流动相为甲醇-0.1%磷酸（20∶80），检测波长为210 nm，柱温30 ℃，流速1 mL/min[9-10]。

2    结果与分析

2.1    苦杏仁苷标准曲线的绘制

精密称取苦杏仁苷标准品12.50 mg加50%甲醇定容至25mL，分别吸取此溶液0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL用50%甲醇定容至25 mL，以20 μL定量阀进样，测定峰面积A。以苦杏仁苷浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，求得回归方程为Y=183.99X-0.028 6，R2=0.999 9，结果表明苦杏仁苷浓度在0.012 5～0.250 0 μg/mL范围内呈良好的线性关系（图2）。

2.2    单因素试验

2.2.1    乙醇体积分数对苦杏仁苷得率的影响。取脱脂粕5 g，设定提取温度70 ℃、提取时间2 h、料液比1∶40（g∶mL）和超声工作时间30 min、超声处理温度60 ℃时，考察乙醇体积分数为65%、70%、75%、80%、85% 和95%时对苦杏仁苷得率的影响，结果见图3。可以看出，随着乙醇体积分数提高，苦杏仁苷得率均呈现出先增大后减小的趋势，在乙醇体积分数为85%时，苦杏仁苷得率达到最大。这可能是由于随着乙醇体积分数的增加，蛋白质变性加快，妨碍乙醇溶液向细胞内渗透，阻止了苦杏仁苷的溶出，从而影响了苦杏仁苷提取[11]。故本工艺提取苦杏仁苷的最佳乙醇体积分数为85%。

2.2.2    提取温度对苦杏仁苷得率的影响。取脱脂粕5 g，设定乙醇体积分数85%、提取时间2 h、料液比1∶40（g∶mL）、超声工作时间30 min、超声处理温度60℃时，考察提取温度为65、70、75、80、85、90、95 ℃时对苦杏仁苷得率的影响，结果见图4。可以看出，苦杏仁苷得率随着提取温度的升高而增加，当提取温度达到85 ℃后，苦杏仁苷得率的增加趋于平缓。这可能是因为苦杏仁苷在冷乙醇中溶解度很低，而在热乙醇中溶解度增大;与此同时，随着提取温度的上升，溶液的黏度下降、扩散系数增大，从而促使苦杏仁苷向提取液中扩散，从而影响了苦杏仁苷的提取[12]。故本工艺提取苦杏仁苷的最佳提取温度为85 ℃。

2.2.3    提取时间对苦杏仁苷得率的影响。取脱脂粕5 g，设定乙醇体积分数85%、提取温度85 ℃、料液比1∶40（g∶mL）、超声工作时间30 min、超声处理温度60 ℃，考察提取时间为20、40、60、80、100、120、140 min时对苦杏仁苷得率的影响，结果见图5。可以看出，苦杏仁苷得率随着提取时间的延长而增加，当提取时间达到60 min后，苦杏仁苷得率变化不明显。从节能考虑，本工艺提取苦杏仁苷的最佳提取时间为60 min。

2.2.4    料液比对苦杏仁苷得率的影响。取脱脂粕5 g，设定乙醇体积分数85%、提取温度85 ℃、提取时间60 min、超声工作时间30 min、超声处理温度60 ℃时，分别考察料液比为1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50（g∶mL）时对苦杏仁苷得率的影响（图6）。可以看出，苦杏仁苷得率随着料液比增加而增加，当料液比达1∶35（g∶mL）后，苦杏仁苷得率趋于平缓。对于一定质量的脱脂粕而言，溶剂用量增加时，脱脂粕与溶剂接触界面处的浓度差增加，传质速率提高，提取率增大。当溶剂量增大到一定程度后，提取率无明显变化。从节省溶剂考虑，本工艺提取苦杏仁苷最佳料液比为1∶35（g∶mL）。

2.2.5    超声工作时间对苦杏仁苷得率的影响。称取脱脂粕5 g，设定乙醇体积分数85%、料液比1∶40（g∶mL）、提取温度85 ℃、超声处理温度60 ℃、提取时间60 min，分别设定超声工作10、15、20、25、30、35 min条件进行提取，考察不同超声工作时间对苦杏仁苷得率的影响，结果见图7。可以看出，超声工作时间为30 min时，苦杏仁苷得率达到最大值。这是因为工作时间短时，超声破碎作用较弱，细胞内苦杏仁苷释放不充分;但当超声工作时间过长时，超声波破碎作用增大，细胞的破裂越来越完全，细胞内大量不溶物、淀粉颗粒及黏液质等混入提取液中，使溶液中杂质增多、黏度增大，从而影响了苦杏仁苷的溶出[13]。故本工艺提取苦杏仁苷的最佳超声工作时间为30 min。

2.2.6    超声处理温度对苦杏仁苷得率的影响。称取脱脂粕5 g，设定乙醇体积分数85%、料液比1∶40（g∶mL）、提取温度85 ℃、提取时间60 min、超声工作时间30 min，分别设定超声处理温度为30、40、50、60、70、80、90 ℃进行提取，考察不同超声处理温度对苦杏仁苷得率的影响，结果见图8。可以看出，随着温度升高苦杏仁苷的得率呈上升趋势，当温度升至70 ℃后，苦杏仁苷的得率反而下降。这可能是由于温度较低时提取液的黏度较低，质点传质效果好，扩散系数也较大，有利于苦杏仁苷在乙醇中溶解，因而得率逐渐增大;而当温度大于70 ℃后，随着温度升高苦杏仁苷的得率反而下降，原因可能是苦杏仁苷中酚羟基在高温下易被氧化[14]，随着温度升高可能会导致苦杏仁苷被破坏，导致热敏损失。同时温度过高也会导致桃仁中其他杂质成分的溶出，从而抑制苦杏仁苷的提取。故本工艺提取苦杏仁苷的最佳超声处理温度为70 ℃。

2.3    色谱图

在1.2.6所述工作条件下，测定标准品溶液、样品溶液的色谱图，结果见图9、10。

2.4    优化试验

2.4.1    正交试验。在单因素实验基础上，根据L9（34）四因素三水平（表1）的设计原理，设定乙醇体积分数85%、提取时间60 min，选取料液比（A）、提取温度（B）、超声时间（C）和超声处理温度（D）作为考察变量，采用四因素三水平的分析法，对超声辅助提取苦杏仁苷工艺参数进行优化。

根据表1所列的试验方案进行试验，结果见表2。可以看出，影响苦杏仁苷得率的主次因素为A>D>C>B，正交试验确定的最佳工艺条件为A2B2C3D2，即料液比1∶35（g∶mL）、提取温度85 ℃、超声工作时间30 min、超声处理温度70 ℃。以乙醇体积分数85%、提取时间60 min、料液比1∶35（g∶mL）、提取温度85 ℃、超声工作时间30 min、超声处理温度70 ℃为参数，在此条件下进行超生波辅助提取桃仁中苦杏仁苷的试验，苦杏仁苷得率最高可以达到2.88%。

2.4.2    验证性试验。选定工艺参数乙醇体积分数85%、提取时间60 min、料液比1∶35（g∶mL）、提取温度85 ℃、超声工作时间为30 min、超声处理温度70 ℃进行3组平行验证性试验，结果分别为2.88%、2.89%、2.89%，取平均值为2.89%，与预测值仅相差0.01个百分点。因此，采用正交试验法优化得到的工艺参数准确可靠，具有较高的实用价值。

3    结论

采用超声辅助提取技术对桃仁中苦杏仁苷进行提取，通过设计单因素试验和正交试验对超声辅助提取苦杏仁苷的工艺进行优化。单因素试验采用平行重复取平均值的方法，避免了非必要因素的影响而对试验结果造成偏差。根据单因素试验结果设计L9（34）四因素三水平的正交试验，每个试验重复3次，取平均值。分析正交试验数据及结果，确定影响苦杏仁苷得率因素的主次顺序，得出超声辅助提取苦杏仁苷的较优工艺条件为乙醇体积分数85%、提取时间60 min、料液比1∶35（g∶mL）、提取温度85 ℃、超声工作时间30 min、超声处理温度70 ℃。在较优工艺条件下，苦杏仁苷的率最高可以达到2.88%。最后设计验证性试验，以正交试验确定的较优的工艺条件为参数，进行3组平行试验，在该工艺条件下，苦杏仁苷得率的平均值为2.89%，与预测值仅相差0.01个百分点。因此，正交试验所确定的最优超声辅助提取苦杏仁苷的工艺参数较为准确，符合要求。

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