灵芝三萜对癫痫大鼠学习记忆损伤的效果

农雪娟，金佳熹，周冰玉，张丽凤，洪剑威，赵爽

1.右江民族医学院附属医院检验科，广西百色市 533000；2.右江民族医学院，a临床医学院；b.基础医学院，广西百色市 533000

目前全球约有7000万癫痫患者，90%生活在发展中国家[1]，近一半患者存在认知功能特别是学习记忆功能障碍，严重影响癫痫患者的生活质量[2]。如何改善癫痫后学习记忆等认知受损已成为当前脑科学研究热点之一。既往研究证实，灵芝孢子主要成分灵芝三萜具有抗氧化、提高免疫力、抑制神经细胞凋亡等作用，同时具有一定程度的抗癫痫作用[3-5]。灵芝的主要化学和药效成分为三萜类灵芝酸。外源性单唾液酸四己糖神经节苷脂(monosialoteterahexosyl ganglioside,GM1)对神经受损修复、再生有重大促进作用[6-8]。本研究利用灵芝三萜联合GM1对戊四氮致痫脑损伤后与突触生长重塑密切相关的肌动蛋白结合蛋白(actinbinding protein,Cofilin)、突触素(synaptophysin,SYN)、神经生长相关蛋白43 (growth-associated protein 43,GAP-43)等基因表达进行实验研究，从而进一步探讨癫痫的发病机制和灵芝药效成分的抗痫机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠75只，体质量(200±20) g，购自长沙市天勤生物技术有限公司[SCXK(湘)2014-0011]。动物饲养在右江民族医学院实验动物中心[SYXK(桂)2017-0004]，对实验动物的操作处理符合医学伦理学标准和动物3R原则，均已经过右江民族医学院伦理委员会批准。所有动物按自然昼夜，普通环境饲养，室温(25±1)℃，自由饮食。

1.2 主要试剂与仪器

戊四氮：美国SⅠGMA公司。GM1注射液：齐鲁制药有限公司。灵芝三萜化合物(三萜含量249 g/kg)：广州白云山汉方现代药业有限公司。AxyPrep总RNA小量制备试剂盒：美国AXYGEN公司。RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit：赛默飞科技有限公司。FastStart Universal SYBR Green Master：瑞士罗氏公司。Cofilin、SYN、GAP-43 mRNA PCR引物合成：生工生物工程(上海)股份有限公司。ABⅠ7500实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)仪：美国ABⅠ公司。HT7700透射电子显微镜：日本HⅠTACHⅠ公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组及处理

将实验动物分为空白对照组、癫痫模型组、灵芝三萜组、GM1组和灵芝三萜联合GM1组，共5组，每组15只。

除空白对照组外，其余各组腹腔注射亚惊厥剂量戊四氮35 mg/kg，每天1次，持续28 d，复制慢性癫痫模型。空白对照组以等容生理盐水腹腔注射。

同时，癫痫模型组灌胃同体积生理盐水；灵芝三萜组每天灌胃灵芝三萜1000 mg/kg；GM1组腹腔注射GM130mg/kg；灵芝三萜联合GM1组灌胃灵芝三萜1000 mg/kg，腹腔注射GM1 30 mg/kg。空白对照组灌胃同体积生理盐水。灌胃前禁食6 h。

大鼠癫痫发作评分标准按Ono法[9]：0级，行为上无任何形式的发作反应；Ⅰ级，节律性点头或面部抽动；Ⅱ级，阵挛性咀嚼或点头甩尾；Ⅲ级，头部颤搐加前肢阵挛性抽搐；Ⅳ级：呈袋鼠姿势或多肢抽动；Ⅴ级，身体失去平衡，甚至倾倒；Ⅵ级，全面持续强直-阵挛发作。注射后每天观察大鼠30～60 min，记录癫痫发作的级别，出现连续5次≥Ⅱ级惊厥发作即为造模成功。

1.3.2 检测方法

1.3.2.1 Morris水迷宫测试

定位航行实验：造模成功后次日每组随机抽取10只大鼠进行定位航行实验，历时5 d。第1天让大鼠自由游泳1 min后开始训练，每天同一时段训练4次，训练时随机选择入水点，将大鼠面向池壁放入水中，观察记录大鼠每次自入水至寻找到并爬上平台所需时间，即逃避潜伏期(s)。4次训练分别从4个不同入水点入水，如果大鼠在60 s内未找到平台，潜伏期记为60 s，每次训练间隔60 s。

空间探索实验：第6天进行，用于测量大鼠对平台空间位置的记忆能力。撤走平台，将大鼠面向池壁任选一个入水点入水，测试大鼠在60 s内跨过原平台所在位置的次数，同时记录在目标象限停留时间。

1.3.2.2 海马神经元病理组织学检查

行为学实验完成后，10%水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，冰上快速断头取脑，各组随机选取5只大鼠脑组织，4%多聚甲醛固定24 h，95%～75%梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋，4μm连续切片，常规苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色，光学显微镜下观察各组脑海马CA1区锥体细胞数目及形态结构改变。

1.3.2.3 透射电镜观察神经元超微结构

各组再随机取3只大鼠脑组织，分离海马组织，立即放入2.5%戊二醛缓冲液中，参照脑立体定位图谱将CA1区海马组织切成数个1×1×1 mm小块，再放入2.5%戊二醛缓冲液，4 ℃冰箱固定2～4 h，常规包埋，超薄切片，经铀铅双染色(2%醋酸铀饱和酒精溶液、枸橼酸铅，各染色15 min)，透射电子显微镜下观察神经元超微结构。

1.3.2.4 实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)

各组其余的7只大鼠断头取脑，于冰上用冰生理盐水漂洗大脑血渍，再用滤纸拭干后取出海马组织，立即装入冷冻管中，并将冻存管迅速放入液氮中保存。按AxyPrep总RNA小量制备试剂盒说明提取总RNA，按RNA PCR试剂盒说明进行qPCR反应，GADPH作内参，检测海马Cofilin、SYN和GAP-43的mRNA表达水平。qPCR引物序列见表1。

表1 目的基因与内参照引物序列

反应结束后，数据处理采用2-△△CT法(Livak法)进行分析处理，再根据所得的数据计算出海马Cofilin、SYN和GAP-43的mRNA相对表达量。

1.4 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行分析，所有计量资料均经过正态性检验，符合正态分布，以()表示。采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，两两比较采用LSD检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 Morris水迷宫测试

定位航行实验显示，各组逃避潜伏期随时间有不断缩短趋势。与空白对照组比较，各时间点癫痫模型组逃避潜伏期延长(P＜0.05)；与癫痫模型组比较，各用药组逃避潜伏期均缩短，部分时间点有显著性差异(P＜0.05)。见表2。

空间探索实验显示，与空白对照组比较，癫痫模型组穿越平台次数明显减少(P＜0.01)，在目标象限停留时间明显缩短(P＜0.01)；与癫痫模型组比较，各用药组穿越平台次数均明显增多(P＜0.01)，在目标象限停留时间明显延长(P＜0.01)。见表3。

2.2 海马神经元病理组织学

空白对照组海马CA1区神经元细胞形态正常，整齐排列，胞质丰富，细胞核大而圆；癫痫模型组海马神经元细胞较少，排列疏松、紊乱，胞质深染，胞核溶解碎裂，呈空泡状；各用药组海马神经元细胞较模型组有所改善，神经元细胞数量增多，细胞形态趋于正常，排列比较整齐，胞核碎裂固缩减少。见图1。

2.3 海马组织透射电镜观察

空白对照组海马CA1区神经元细胞核膜结构清楚，形状规则，突触结构、数量及突触前后囊泡正常，线粒体等细胞器形态正常；癫痫模型组神经元细胞核膜结构不清楚，形状不规则，突触小泡数量变少，突触数量减少，线粒体嵴断裂，部分嵴消失，细胞器肿胀变形；各用药组神经元细胞核膜结构较清楚，突触结构较完整，突触小泡数量增多，突触数量增加，线粒体等细胞器结构有所改善。见图2。

2.4 海马Cofilin、SYN、GAP-43 mRNA表达

与空白对照组相比，癫痫模型组Cofilin mRNA水平上调(P＜0.05)，SYN mRNA和GAP-43 mRNA水平降低(P＜0.05)；与癫痫模型组比较，各用药组Cofilin mRNA表达水平降低(P＜0.05)，SYN mRNA表达水平升高(P＜0.05)，仅灵芝三萜联合GM1组GAP-43 mRNA升高(P＜0.05)。见表4。

表2 各组定位导航实验平均逃避潜伏期(s)

表3 各组目标象限停留时间及穿越平台次数比较

图1 大鼠海马CA1区病理组织学观察(HE染色，×400)

图2 大鼠海马透射电镜观察(×5000)

3 讨论

癫痫是一种脑部神经元过度放电导致突然、反复、短暂的中枢神经系统功能失常的慢性病[10]，已成为神经系统疾病中仅次于脑卒中的第二大常见病[10]。癫痫患者伴随学习记忆下降及认知障碍，可能与反复或长时间痫性发作致缺氧、乳酸酸中毒及神经递质过度兴奋，进而导致继发性神经元代谢及结构损伤有关[11]。

灵芝的主要化学和药效成分之一灵芝三萜可抑制神经细胞凋亡[12]，具有一定程度的抗癫痫作用[5]。外源性GM1也可抑制神经细胞凋亡[13-14]，通过调控脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)信号通路逆转精神障碍引起的认知与记忆损伤[15-16]，提示两药可能对神经元的修复、再生存在协同效应。本项目组前期研究证实[17]，灵芝三萜化合物和GM1可以促进癫痫后神经再生与重塑，从而起到脑保护的作用。

表4 各组海马Cofilin、SYN和GAP-43 mRNA表达比较

Morris水迷宫通过定位航行实验和空间探索实验可用来判断动物对空间定位的学习记忆能力[18]。本研究显示，癫痫模型大鼠学习记忆下降与Jiang等[19]用戊四氮点燃大鼠癫痫模型的结果一致。灵芝三萜和GM1均能改善癫痫大鼠的认知能力，特别是空间学习记忆能力；但未发现联合用药有更明显的效果。

海马是对学习记忆最重要的区域，海马神经元的凋亡、坏死或突触丢失都会导致认知功能特别是学习记忆能力障碍[20]。本研究显示，灵芝三萜和GM1均能改善癫痫引起的神经细胞损伤。

神经元突触的功能与结构可随外界刺激或环境因素的影响发生明显的可塑性变化，神经突触的可塑性变化与癫痫后记忆损伤密切相关，是癫痫及癫痫后记忆认知障碍的病理学基础。SYN作为突触发生和突触重塑的重要标志，在身体所有的神经末端广泛表达，对神经生长、修复再生及突触重塑有重要作用[21]。GAP-43是神经突触可塑性功能因子，与突触联接建立以及突触损伤修复的过程密切相关。SYN和GAP-43表达水平与学习记忆能力密切相关。张岩等[22]的研究发现，海马中SYN和GAP-43 mRNA的表达量升高，可改善大鼠的空间学习记忆能力和认知功能障碍。Cofilin是重要的调节细胞骨架聚合与解聚的因子，参与神经损伤、修复再生过程[23]。Cofilin基因及蛋白水平上调可以破坏原有的正常神经网络，阻碍胞内轴浆运输，诱导海马神经元突触丢失，影响突触可塑性[24]。在脑损伤防治策略中，可以通过下调Cofilin、上调GAP-43的表达，促进神经轴突再生，进而改善神经细胞损伤[25]。

本研究显示，Cofilin蛋白聚集、SYN和GAP-43表达降低可能与癫痫大鼠空间学习记忆功能的损害有关，灵芝三萜和GM1及两者联合用药可改善癫痫大鼠的空间学习记忆能力，可能与其下调Cofilin mRNA水平，促进SYN和GAP-43的mRNA表达，从而提高突触修复及再生能力有关。作用机制还有待进一步研究。联合用药未发现更明显的效果。