疏血通注射液对缺氧缺糖后星形胶质细胞内谷氨酸清除的影响

殷孟兰，徐 耀，袁 庆，牛文兴，王少峡，胡利民，柴丽娟

(天津中医药大学中医药研究院、天津市中药药理学重点实验室、方剂学教育部重点实验室，天津 301600)

脑血管闭塞后，神经元突触前膜释放的谷氨酸无法很快的被突触后膜转运，导致在神经元外部的谷氨酸大量聚集[1]。星形胶质细胞可通过兴奋性氨基酸转运蛋白2(excitatory amino acid transporters 2，EAAT2)清除过量的谷氨酸[2]。有研究表明，EAAT2在急性缺血性脑中风时的表达大量减少，而增加EAAT2的表达可对神经产生保护作用[3]。疏血通注射液以水蛭和地龙为主要成分[4]，早期的研究显示，疏血通对损伤的星形胶质细胞有保护作用[5]，但疏血通注射液是否能通过提高损伤后星形胶质细胞EAAT2的表达，增强对胞外谷氨酸摄取来减轻神经损伤的作用未见研究，本实验就此展开研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂出生1～2 d Wistar大鼠，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，SPF级，许可证号SCXK(京)2016-0006；疏血通注射液(广西梧州制药(集团)股份有限公司，国药准字Z20025652)；单体(1504，MW：1103.3，氨基酸序列：VAPEEHPVLL、1505，MW：1349.5，氨基酸序列：FAGDDAPRAVFPS、1506，MW：1259.5，氨基酸序列：RVAPEEHPVLL)；谷氨酰胺、dBcAMP、Glutamate Assay Kit(美国Gibco公司)；谷氨酸试剂盒(Sigma，美国)；Anti-GFAP(CST，Danvers，MA)；Cell Counting Kit-8(同仁，日本)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(索莱宝，中国)。

1.2 方法

1.2.1星形胶质细胞的原代培养及鉴定 培养方法参考相关文献[6]并根据实验条件进行相应改动。胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光法鉴定，并每天观察细胞生长状况。

1.2.2细胞分组与处理 对照组采用正常全培培养；模型组缺氧时更换细胞培养液为EBSS溶液，放入缺氧小室于37 ℃条件下缺氧培养3 h，复氧时重新换为全培溶液继续培养3 h；给药组于全培中加入0.0625 mmol·L-1的dBcAMP和不同稀释比例的疏血通注射液或单体因子，缺氧3 h，复氧时将上清更换为含100 μmol·L-1高浓度谷氨酸的加药全培溶液继续培养3 h。

1.2.3CCK-8法检测细胞活力 分组处理如“1.2.2”所述，复氧结束后更换细胞上清为10% CCK-8溶液(100 μL/孔)，37 ℃避光孵育30 min，450 nm检测吸光度值。

1.2.4测定谷氨酸浓度 星型胶质细胞于高浓度谷氨酸培养(100 μmol·L-1)3 h后，每孔取50 μL上清至培养板中，加入反应液100 μL/孔，混匀后于37 ℃摇床孵育30 min，450 nm检测吸光度；裂解细胞，BCA法测定蛋白浓度已对谷氨酸浓度进行校正。

1.2.5蛋白免疫印迹法测定EAAT2的蛋白表达 蛋白样品经电泳，转膜，封闭后，加入配置好的EAAT2 Rabbit(1 ∶1 000)及 β-actin(1 ∶1000)一抗于4 ℃滚轴过夜；次日TBST洗涤3次，加入IgG-HRP二抗(1 ∶10 000)，最后使用Amersham Imager 600多功能成像仪显影。

2 结果

2.1 疏血通注射液对损伤星形胶质细胞活力的影响如Tab 1所示，与对照组比较，Hypo/Reox组细胞活力显著降低(P<0.01)；与Hypo/Reox组相比，疏血通不同浓度组以及单体成分1504、1505、1506均能显著提高缺氧复氧损伤后星形胶质活力(P<0.01)。

2.2 疏血通注射液对胞外谷氨酸的清除能力的影响如Tab 1所示，与对照组比较，Hypo/Reox组培养液中谷氨酸浓度显著升高(P<0.01)，提示损伤后星形胶质细胞对谷氨酸清除能力明显降低；与Hypo/Reox组比较，疏血通注射液中剂量组、低剂量组和单体因子1505组培养液中谷氨酸浓度显著降低(P<0.01)，提示其能明显改善受损星形胶质细胞对胞外高浓度的谷氨酸的清除能力。

2.3 疏血通注射液对星形胶质细胞上EAAT2蛋白表达的影响如Tab 1所示，与对照组比较，Hypo/Reox组EAAT2蛋白表达量显著降低(P<0.01)；与Hypo/Reox组相比，疏血通注射液低、中剂量组和单体因子1505组EAAT2蛋白表达明显升高(P<0.01)，表明疏血通注射液和单体因子1505对缺血缺氧后星形胶质细胞的谷氨酸转运有一定的影响。

Tab 1 Effect of Shuxuetong Injection on activity of damaged astrocytes, extracellular glutamate clearance and

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vshypo/Reox

3 讨论

谷氨酸作为一种重要的神经递质，主要由神经元释放，能通过与神经元突触后膜受体结合，维持正常神经系统功能[7]；但谷氨酸也具有潜在的兴奋毒性，脑缺血后谷氨酸的大量聚集会加剧神经细胞的死亡[8]。因此，增强星形胶质细胞对谷氨酸的摄取尤为重要。本研究结果表明，疏血通注射液可明显升高EAAT2的表达，降低细胞外谷氨酸浓度，提示疏血通注射液可以增加缺氧缺糖后星形胶质细胞谷氨酸转运体的转运，提高星形胶质细胞对于胞外高浓度谷氨酸的摄取能力，可能发挥一定的神经保护作用，且单体因子1505(MW：1349.5，氨基酸序列：FAGDDAPRAVFPS)对谷氨酸同样具有较明显的清除作用，可能为疏血通注射液发挥谷氨酸清除作用的药效物质基础。